马应龙麝香痔疮膏中间体中煅炉甘石与冰片近红外含量模型建立

宋侨，胡俊杰，白玉，郑国华

(1.湖北中医药大学药学院，中药资源与中药复方教育部重点实验室，湖北 武汉 430065；2.马应龙药业集团股份有限公司，湖北 武汉 430065)

马应龙麝香痔疮膏是治疗肛肠疾病的一种常用软膏制剂[1]，具有活血消肿、清热燥湿、去腐生肌[2]等功效。该处方主要由人工麝香、人工牛黄、珍珠、煅炉甘石、硼砂、冰片、琥珀等7味药组成，7种药材粉末组成的中间体的含量高低将直接影响最终制剂的含量，因此，控制中间体的质量对于制剂质量具有极其重要的意义。《中国药典》2015年版中马应龙麝香痔疮膏的含量测定是以煅炉甘石和冰片为检测指标，常规的分析方法采用配位滴定法和气相色谱法。但该方法操作烦琐、费时费力，无法实现在生产过程中大量样品的含量检测。因此，寻找出一种快速、高效的质量分析方法具有重要意义。

近红外光谱技术具有分析速度快、低成本、无样品损耗[3-4]等优点，在药物分析及药品监督检查领域[5]应用越来越广泛。近年来，近红外光谱技术在中药领域的研究已有多项报道[6-7]，本研究尝试利用近红外光谱技术建立马应龙麝香痔疮膏中间体含量快速检测模型。

1 仪器与材料

1.1 仪器 MPA傅立叶变换近红外光谱仪(德国布鲁克光学仪器公司)；万分之一分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司)；超声波清洗器(广东固特超声股份有限公司)。

1.2 材料 三氯甲烷(批号：20160206)、盐酸(批号：2015010607)、铬黑T均购自上海凌峰化学试剂有限公司)；水杨酸甲酯(天津博迪化工股份有限公司)；0.05 mol·L-1乙二胺四乙酸二钠标准溶液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氨水(批号：20170605)、氯化铵(批号：20180505)、磷酸氢二钠(批号：20180810)、三乙醇胺(批号：20140110)、环己烷(批号：20100105)、乙酸乙酯(批号：20140310)等均购自国药集团化学股份有限公司；龙脑对照品(批号：110881-201508，含量96.8%)、异龙脑对照品(批号：111512-201603，含量96.7%)均购自中国食品药品检定研究院；冰片、50 mL锥形瓶、50 mL容量瓶、50 mL分液漏斗、烧杯、漏斗、滤纸、去离子水、248批中间体粉末，中间体粉末由马应龙药业股份有限公司提供。

2 试验方法

2.1 样品制备 将总混合粉末按照马应龙麝香痔疮膏配方进行人为配比，只改变配方中煅炉甘石的配比比例，使其在配方中比例变化在常规比例的-15%、-14%、-13%……+13%、+14%、+15%，每个比例变化值用4个不同批次样品配备，共配比124批粉末并混匀(150目)，编号a1～a124；按照相同步骤改变配方中冰片的配比比例，混匀，得到124批粉末编号b1～b124。

2.2 煅炉甘石含量测定 按照《中国药典》2015年版马应龙麝香痔疮膏项下煅炉甘石含量测定方法，采用配位滴定法测量124批样品中ZnO的含量。结果显示，ZnO含量在49.7%～68.8%内与乙二胺四乙酸二钠用量呈现良好的线性关系，回归方程为Y=49.144X+0.006 2(R2=1.000 0)。每批样品平行测量3次，取平均值作为ZnO含量参考值。

2.3 冰片含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱型号为DB-WAXETR毛细管柱(0.32 mm×30 m，1 μm)。进样口温度250 ℃，柱温130 ℃，检测器温度250 ℃。分流比为10∶1。理论塔板数(以水杨酸甲酯峰计)为20 208，龙脑、异龙脑的分离度分别为12.828、15.788。对照品色谱图见图1。

2.3.2 内标溶液制备 取水杨酸甲酯适量，精密称定，加环己烷-乙酸乙酯(1∶1)制成每1 mL含3 mg的溶液。

2.3.3 对照品溶液制备 分别称取适量龙脑、异龙脑、冰片对照品，精密称定，加入内标溶液制成每1 mL含2 mg的溶液。

2.3.4 供试品溶液制备 取已混合均匀的中间体粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标液10 mL，混匀，称定重量，超声处理15 min，放冷，在称定重量，用环己烷-乙酸乙酯(1∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3.5 含量测定 分别吸取龙脑对照品溶液与供试品溶液1 μL注入气相色谱仪。依据对照品中龙脑的含量计算出供试品溶液中龙脑的含量，作为中间体粉末中冰片的含量。

2.3.6 方法学考察

2.3.6.1 线性关系考察 精密称取龙脑对照品150.13 mg，置于25 mL容量瓶中，加入内标溶液溶解并稀释至刻度线，摇匀，得到对照品溶液。从对照品溶液中分别吸取1、2、3、4、5 mL至10 mL容量瓶中，加内标液稀释至刻度。上述6个浓度点以浓度为横坐标，对照品峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标建立标准曲线。结果得龙脑回归方程为Y=0.488 3X-0.015 5(R2=0.999 6)

说明龙脑在6.005 2～60.052 mg范围内进样量与对照品峰面积与内标物峰面积比值具有良好的线性关系。

2.3.6.2 精密度考察 精密称取龙脑对照品2.06 mg加入10 mL容量瓶中稀释至刻度，按照“2.3.1”项下色谱条件连续测定6次并计算校正因子。结果6次校正因子平均值为0.677 95，RSD值为0.32%。试验结果表明本方法精密度较好。

A.冰片样品;B.龙脑对照品;C.异龙脑对照品 1.龙脑;2.水杨酸甲酯;3.异龙脑

2.3.6.3 重复性考察 取其中一批配比的样品(b64)，按照“2.3.4”项下平行制备6份样品，按测定方法平行测定6份样品中龙脑的含量，结果显示龙脑的平均值为43.14 mg·g-1，RSD为0.71%，表明本方法重复性良好。

2.3.6.4 稳定性考察 在上述制备的6份样品中随机选取一份样品，分别在0、2、4、6、12、24 h测定其含量，RSD为0.64%，表明所制样品在24 h内稳定性良好。

2.3.6.5 加样回收试验 精密称取已知含量的中间体粉末(b2，龙脑含量35.12 mg·g-1)6份，每份0.5 g，分别加入17.5 mg龙脑对照品，按照制备供试品的方法制备样品并测定回收率，结果见表1，结果表明本方法龙脑平均回收率为99.65%，RSD为0.58%，符合规定。

2.4 中间体粉末光谱采集 取以上所有中间体样品约1 g，分别置于样品测试杯中，在12 500～4 000 cm-1处扫描，分辨率为8 cm-1，扫描次数为32次，每个样品重复测量3次，求得平均光谱用于分析。样品光谱信息见图2。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.5 样本集的划分 利用K-S方法[8]，将a样品与b样品分别划分训练集a与测试集a、训练集b与测试集b。其中训练集a共87份样品，测试集a共37份样品、训练集b共86份样品，测试集b共38份样品。具体样品信息见表2。

图2 中间体近红外光谱

表2 定量模型训练集与测试集样品信息

3 试验结果

3.1 光谱预处理方法的选择 近红外光谱仪所采集的光谱除样品的自身信息外，还包含了其他无关信息和噪声，如电噪声、样品背景和杂散光等[9]。因此，需要对光谱进行预处理。矢量归一化法(vector normalization,VN)可以消除微小光程差带来的图谱变动；导数处理可以校正基线并分辨重叠峰，多元散射校正可消除固体颗粒大小带来的影响[10]。本试验利用OPUS/QUANT-2定量分析软件进行数据处理时，在全谱段范围内对光谱进行矢量归一化(VN)，一阶导数(first derivative,FD)，二阶导数(second derivative,SD),多元散射校正(multiple scatter correction,MSC)以及它们的组合[11]等对光谱进行预处理，并分别建立定量分析模型a(a样品)与模型b(b样品)，结果见表3。试验过程中以模型的决定因子(R2)、内部验证均方差(RMSECV)和相对分析误差(RPD)综合评价所建定量分析模型。其中R2越接近1，RMSECV 越小，说明建模性能越好。通常认为RPD>3，模型的预测精度高，如果RPD<2.5，需重新建立模型。

表3 全谱段范围内用不同预处理方法建立的中间体粉末定量分析模型

由表3可知，对于中间体a(只改变配方中煅炉甘石比例样品)，当采用一阶导数(21点平滑)为预处理方法时，所建立的ZnO定量分析模型RMSECV值最小，R2值最大且RPD值最大，故选用FD(21点平滑)作为预处理方法。对于中间体b(只改变配方中冰片比例样品)，当采用一阶导数(25点平滑)与多元散射校正为预处理方法时，所建立的冰片定量分析模型效果最好，因此选用该方法作为预处理方法。

3.2 光谱特征谱段的选择 在建PLSR定量分析模型时，为提高模型的预测能力和稳健性，常对光谱进行谱段筛选，区间偏最小二乘(iPLS)是将全谱等分成n个子区间，分别建立回归模型，筛选出最佳谱段。本试验将全谱段分别划分为5、6、7、8、9、10个区间,不同区间下所筛选的最优谱段及模型的效果见表4。在“3.1”项下评价方法基础上，同时利用测试集样品进行外部验证，以测试集验证均方差(RMSEP)评价模型效果，其中R2越接近1，RMSEP越小表示模型预测能力越强。综合考虑内部交叉验证结果和外部验证结果，确定最佳区间数和特征谱段。

由表4可知，对于a模型，当全谱段被划分为6个区间，在12 493.3～11 073.9、8 246.6～6 823.3、5 411.6～3 999.9 cm-1，所建立的定量模型最优；对于b模型、全谱段划分为10个区间，在9 947.6～8 246.6、7 398～5 697、4 852.3～3 999.9 cm-1，所建立的模型效果最好。因此选择以上谱段作为相应定量模型的建模谱段。

3.3 模型评价与预测 在建立PLS模型时，主成分数对模型的预测能力有着极其重要的影响，主成分数过多会使得模型“过拟合”，过少则会“欠拟合”[12]，都会降低模型的预测能力。本研究以RMSECV作为优化参数来确定最佳主成分数(Rank值)，RMSECV与Rank值关系见图3。模型参数确定后，用此模型对测试集样品进行外部验证，其分析结果见图4。以模型预测值与参考值的相对偏差来评价模型的预测能力，对于a、b模型，平均相对偏差分别为1.27%、1.4%，表明两个模型预测能力良好。

表4 划分不同区间所建立的中间体粉末定量分析模型

图3 训练集样品RMSECV与Rank值关系图

图4 外部验证结果图

4 讨论

本试验对中间体中煅炉甘石和冰片粉末的含量进行分析，所建立的分析模型可以准确快速地检测未知含量的中间体中煅炉甘石与冰片的含量。在进行冰片含量测定时，由于实验仪器原因并未采用药典上的色谱条件，本试验采用的方法经方法学考察表明该方法测定的冰片含量数据较为准确。由于试验中所用的样品数目有限，因此模型的适用性具有一定限制，日后随着样本数的增加，对模型不断进行优化，模型的适应性将更加广泛。