新型冠状病毒N蛋白优势表位区段抗原的克隆表达及其诊断价值初步评价

王坤，张玲，王超男，陈远哲，范占科，李垚，刘念，冯晓燕，付强，张贺秋，

1.滨州医学院，山东 烟台 264003；2.东方海洋（北京）医学研究院，北京 100071

2019年底，全球陆续出现了一系列原因不明的肺炎病例，2020年2月11日，国际病毒分类委员会（ICTV）将该病原体新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus2，SARS-CoV-2），世界卫生组织（WHO）将这一病毒导致的疾病正式命名为新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1]。SARS-CoV-2 属于冠状病毒β属，其遗传物质是单正链RNA，基因组包含29 891个核苷酸，与2003年暴发的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的同源性为82%。SARS-CoV-2的结构蛋白主要包括棘突糖蛋白（S）、包膜糖蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。N蛋白与基因组RNA形成复合物，在病毒粒子组装过程中与病毒膜蛋白相互作用，在提高病毒转录和组装效率方面起关键作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体[2]。

血清学改变是COVID-19患者疾病发展过程中的普遍事件，会发生在感染的早期并一直持续至感染后期，甚至康复期。检测COVID-19患者血清中产生的抗体，可做到早诊断、早隔离、早治疗。病毒感染时，血清中出现的抗体主要是IgM和IgG。IgM抗体表明活跃或最近的感染；IgG抗体在感染中出现较晚，通常表明既往感染，但不排除最近感染的患者，这些患者可能仍然具有传染性，特别是当同时检测到IgM抗体时[3]。为了提高抗体检测试剂的性能，我们利用生物学软件分析了N蛋白氨基酸序列的B细胞表位分布及疏水性，选取含有优势表位的抗原区段进行克隆表达，并对其诊断价值进行了初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料

23例经临床确诊的COVID-19患者血清标本、20例乙肝患者血清样本和40例健康体检者血清样本均由广州市第八人民医院提供。大肠杆菌BL21、质粒pColdi为本室保存；DNA限制内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ购自Promega公司；HRP标记的抗人IgG、IgM二抗购自Bethyl公司。

1.2 N蛋白抗原性分析及优势表位区段筛选

采用BIOSUN生物信息学软件分析新型冠状病毒N蛋白氨基酸序列，首先输入全长序列，然后利用B细胞表位分析功能，根据表位峰值的高低筛选确定优势表位区段。

1.3 N蛋白优势表位区段抗原表达质粒构建

由北京诺赛生物技术有限公司合成N蛋白优势表位抗原的编码基因，采用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点，通过双酶切，将N蛋白优势表位抗原的编码基因插入同样经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切的pColdi质粒，获得pColdi-NP重组质粒。

1.4 抗原纯化及制备

将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落于3 mL含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于250 mL新鲜的LB液体培养基中，37℃、160 r/min培养4 h至对数生长期，加150 μL 1 mol/L 的 IPTG，15℃诱导12～14 h，4℃、6000 r/min离心10 min收集菌体；用25 mmol/L Tris-HCl（pH8.5）重悬菌体，冰浴超声，4℃、12 000 r/min离心10 min收集上清，过滤备用。Ni柱纯化，平衡后，将处理好的样品缓慢上样，待吸光度值开始上升时收集穿过液；平衡后，依次用含25、250 mmol/L 咪唑的 25 mmol/L Tris-HCl（pH8.5）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳分析纯化产物，验证纯化后的目的蛋白。

1.5 抗原纯度及相对分子质量测定

利用Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for Windows软件分析纯化后N蛋白优势表位抗原的相对分子质量和纯度。

1.6 N蛋白优势表位抗原活性鉴定

采用Biocore结合实验检测抗原抗体的相互作用，分别用PBS以1∶100稀释阳性血清和阴性血清。传感器预处理后，以5 μL/min的速率通入血清进行抗体绑定，通入时间分别为1.2 min。随后将1 mg/mL N蛋白优势表位抗原以30 μL/min的速率通入进行结合，通入时间为6 min。解离时间与结合时间相同。

1.7 ELISA法鉴定N蛋白优势表位抗原活性和特异性

采用ELISA方法检测人血清样本中抗新型冠状病毒N蛋白IgM/IgG抗体。用碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）稀释N蛋白优势表位抗原，浓度为2.5 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃过夜；用洗涤液洗板2 次，200 μL/孔；加入 110 μL/孔封闭液（0.01 mol/L PBS，1%BSA，pH7.2），室温封闭6 h；用洗涤液洗板 5 次，200 μL/孔；真空干燥 4～6 h。检测时，每孔加入100 μL样品稀释液后，分别加入5 μL待测血清，37℃反应30 min，弃液，用洗涤液洗板 5 次，300 μL/孔，拍干，加入 100 μL/孔 HRP标记的抗人IgM/IgG抗体，37℃孵育20 min；用洗液洗板5次，200 μL/孔；加入TMB显色底物A、B液各50 μL，充分混匀，37℃避光反应10 min；加入 50 μL/孔 2 mol/L H2SO4终止反应，终止后 10 min内采用酶标仪测定各孔的D450nm值。

1.8 统计学分析

运用GraphPad Prism 5软件对检测结果进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，绘制ROC曲线，以约登指数最大判断Cut-off值，≥Cut-off值判定为阳性，＜Cut-off值判定为阴性，并计算灵敏度与特异性。

2 结果

2.1 新型冠状病毒N蛋白优势表位抗原区段的确定

利用BIOSUN生物学软件分析寻找B细胞表位，根据表位分布图最终确定N蛋白优势表位抗原区段为15～215 aa（图1）。

图1 新型冠状病毒N蛋白B细胞表位分析

2.2 抗原表达、纯化与鉴定

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌诱导表达，Ni柱纯化后获得纯化抗原，电泳分析纯化产物，验证纯化后的目的蛋白在250 mmol/L咪唑洗脱液中（图2）。Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for Windows软件分析结果表明，纯化后N蛋白优势表位抗原的相对分子质量为28.10×103，纯度为96.23%（图3）。

图2 N蛋白优势表位区段抗原SDS-PAGE鉴定

图3 N蛋白优势表位抗原相对分子质量（A）和纯度（B）分析

2.3 N蛋白优势表位区段抗原活性的初步评价

采用Biocore结合实验检测抗原抗体的相互作用，动力学数据见表1。ka为结合速率常数，反映大分子间的作用结合速度；kd为解离速率常数，反映分子复合物解离速度；KD为解离平衡常数（KD=kd/ka）。结果显示，阳性血清与N蛋白优势表位抗原的结合速率常数显著高于阴性血清，同时，阳性血清与N蛋白优势表位抗原的解离速率常数显著低于阴性血清。

表1 抗原抗体结合力分析

2.4 COVID-19患者血清中的IgM、IgG抗体检测

用N蛋白优势表位区段抗原包被酶联板，间接ELISA法对23例经临床确诊的COVID-19患者血清标本、20例乙肝患者和40例健康体检者血清样本进行抗N抗原IgM和IgG抗体检测，结果如图4。COVID-19患者血清中IgM和IgG抗体水平均显著高于健康体检者和乙肝患者组（P＜0.0001）。根据ROC曲线，IgM抗体诊断COVID-19的AUC值为0.797，IgG抗体诊断COVID-19的AUC值为0.998。对于IgM检测，以约登指数最大时的D450nm=0.123为临界值，IgM对COVID-19检测的灵敏度为 60.87%（14/23），特异性为 90%（36/40）。对于IgG检测，以约登指数最大时的D450nm=0.178为临界值，IgG对COVID-19检测的灵敏度为95.65%（22/23），特异性为100%（40/40）。

图4 N蛋白优势表位区段抗原血清学检测性能

3 讨论

2019年12月暴发的COVID-19感染性疾病在全球蔓延，成为国际关注的重大突发事件，据报道人与人之间的传播潜伏期为2～14 d，通过飞沫、受污染的手或物体表面传播[4]。随着SARSCoV-2感染的流行，迫切需要一种准确、快速、低成本的实验室病原学诊断方法。COVID-19流行数据表明，血清学反应，尤其是病毒特异性IgM和IgG，是有效的血清学辅助诊断标志物[5]，有助于COVID-19的诊断，包括PCR结果阴性或无临床症状的感染者[6]。冠状病毒所编码的抗原中，N蛋白具有较高的免疫原性，可在早期感染时分泌到体液中，有可能作为抗原检测的生物标志物，同时抗N蛋白抗体可被用于检测冠状病毒感染[7]。

本研究为了获得高活性N蛋白抗原，通过生物学软件分析选取了优势表位区段抗原并获得了高效表达，采用Biocore结合实验初步确定15～215 aa优势表位区段抗原可以与COVID-19患者血清样本发生特异性抗原抗体反应。接下来放大样本进行检测，结果显示基于本研究优势表位区段抗原所建立的IgM和IgG检测方法可以很好地区分COVID-19患者和健康对照，尤其是IgG检测具有优异的检测性能。

在本研究中，抗NP-IgM（90%）和抗NP-IgG（100%）检测的特异性均较高，但本次实验检测的COVID-19患者中抗NP-IgG的阳性率（95.65%）却显著高于抗NP-IgM的阳性率（60.87%），这可能是由于IgM抗体出现在感染最早期，抗NP-IgM的血清转化发生在发病后7～12 d，而有些患者则发生在症状出现后1 d[8]。随着感染时间延长，一些患者的IgM抗体发生阴转，继而出现IgG抗体。血清中抗体的转化时间是因人而异的，同样，由于病情严重程度不同，患者的血清学反应也会有所不同[9]。本研究入组的COVID-19患者均已确诊并入院治疗，并非全部为早期感染者，所以NP-IgM的阳性率较低。根据本研究结果综合考虑，抗NP-IgG和抗NP-IgM对COVID-19的鉴别诊断都有价值，在早期筛查诊断中应该将两者联合使用，以提高诊断效率和筛查准确率。而在大规模流行病学调查中，由于IgG在患者体内存在时间更长久，NP-IgG是更好的检测标志物。

据报道，COVID-19抗体检测方法还可检测针对SARS-CoV-2中S蛋白的血清IgM/IgG抗体[10]。研究发现，抗N蛋白与抗S蛋白抗体联合检测可在发病后1周内将阳性率从41.7%显著提高至75%[11-12]，将抗N蛋白抗体与抗S蛋白抗体检测相结合，是提高COVID-19筛查能力的更有效策略。因此，为了进一步提高抗体检测的灵敏度，我们在后期研究中设计将易表达的N蛋白优势表位区段与难表达的S蛋白优势表位区段构建成一个融合表达抗原，进一步提高检测的灵敏度和特异性。