基于香豆素母核的磺酰腙类乙酰胆碱酯酶抑制剂的制备

赵友芳，黄国娟，陈娅芳，於 祥

(贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

香豆素是一种具有苯并α-吡喃酮的结构，分子式为C9H6O2，分子量为146.04，其结构式如图1所示。香豆素类化合物是一类具有香豆素母核的杂环化合物，具有抗癌[1]、抗炎[2]、抗菌[3]等生物活性。此外，香豆素类化合物对乙酰胆碱酯酶也具有抑制活性，如8-羟基香豆素[4]、蛇床子素[5]等，都表现出一定的对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。磺酰腙类化合物因含有-NHN=CH-结构，具有很强的配位能力，也具有多种生物活性[6]。

为研究新型高效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，本论文采用亚活性结构拼接的方法，以7-二乙氨基香豆素为母核，引入磺酰腙结构，将两种活性结构连接在一起，设计合成了3个衍生物(合成路线如图2所示)，并采用Ellman法[7]测定了目标化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。

图1 香豆素结构

图2 目标化合物的合成路线

Fig.2 The synthetic route of the target compounds

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 600 MHz 核磁共振仪 (Bruker 公司)，TMS为内标；Thermo DSQ 质谱仪(Thermo 公司)；YRT-3型熔点仪(南京旭析仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Heidolph公司)RT-6100酶标分析仪(雷杜公司)；所有试剂与溶剂均为市场所售分析纯级。

1.2 实验部分

1.2.1 中间体2的合成 将称取好的7-二乙氨基-4-甲基香豆素(1，1 mmol)置于50 mL 的圆底烧瓶中，加入10 mL 1,4-二氧六环，升温至60 ℃。称取二氧化硒(1.1mmol)加入反应液中，然后将温度升高到80 ℃，搅拌反应。TLC检测反应进度。反应进行4小时后，底物反应完全。将反应液冷却至室温，过滤，除去反应液中的沉淀。沉淀用20 mL二氯甲烷洗涤。合并有机溶剂，用旋转蒸发器浓缩，薄层硅胶层析分离，得黄色固体2，产率为73%，熔点171～173 ℃。

1.2.2 目标化合物的合成 称取1 mmol 中间体2、1 mmol取代磺酰肼于50 mL圆底烧瓶中。10 mL 无水乙醇溶解。室温搅拌反应。TLC进行跟踪检测反应是否反应完全。5 ～ 12h后，底物反应完全。将反应液冷却至室温直到没有固体析出。然后抽滤，所得固体用无水乙醇重结晶得腙类衍生物3a -c。

1.2.3 活性测定 采用Ellman法[7]对AChE体外抑制活性进行测试。将称好的样品加适量二甲亚砜溶解后加pH 7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)溶液，配制成1mmol/L的待测溶液。阳性对照采用他克林，空白对照采用磷酸缓冲液(PBS)溶液。测定时首先在96孔板上加入用待测样品10 μL，再依次加入40 μLPB、20 μL 2.5 mmol/L 的5,5-二流双硝基苯甲酸(DTNB)、10 μL的电鳗乙酰胆碱酯酶，振荡混匀，37℃预孵10min，然后加入20 μL 10 mmol/L的碘化硫代乙酰胆碱，37℃反应10min，加入30μL 1%的SDS终止反应，酶标仪测定405nm吸收值并计算样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。

2 结果与讨论

目标化合物的合成路线图如图2所示。本论文以1,4-二氧六环做溶剂，SeO2做氧化剂，将7-二乙氨基-4-甲基香豆素的甲基氧化成醛基，然后与取代磺酰肼反应，生成7-二乙氨基香豆素磺酰腙类衍生物。所有目标化合物都经熔点、1H NMR和MS进行结构确证。解谱数据如下;

3a：产率70%，黄色固体，熔点176～178 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO ～ d6) δ：12.21(s，1H)，8.00 (d，J=9.6 Hz，1H)，7.98 (s，1H)，7.91～7.92 (m，2H)，7.69～7.71 (m，1H)，7.64 (t，J=7.2 Hz，2H)，6.69 (dd，J = 9.6，2.4 Hz，1H)，6.51 (d，J=2.4 Hz，1H)，6.15 (s，1H)，3.41 (q，J=7.2 Hz，4H)，1.11 (t，J=7.0 Hz，6H)；MS m/z：422.1 ([M+Na]+，100)。

3b：产率67%，黄色固体，熔点160～162 ℃；1H NMR (600 MHz，DMSO～d6) δ：12.12 (s，1H)，7.99 (d，J=9.0 Hz，1H)，7.96 (s，1H)，7.79(d，J=8.4 Hz，2H)，7.45(d，J=7.8 Hz，2H)，6.67(dd，J=9.0，2.4 Hz，1H)，6.51(d，J=2.5 Hz，1H)，6.15(s，1H)，3.41(q，J=7.2 Hz，4H)，2.37(s，3H)，1.11(t，J=7.2 Hz，6H)；MS m/z：436.0 ([M+Na]+，100)。

3c：产率62%，黄色固体，熔点161～163 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO～d6) δ：12.64 (s，1H)，8.53 (d，J=8.4 Hz，1H)，8.40 (d，J=8.4 Hz，1H)，8.35 (d，J=7.2 Hz，1H)，7.94(s，1H)，7.80(d，J=9.0 Hz，1H)，7.72(t，J=8.4 Hz，1H)，7.61(t，J=8.4 Hz，1H)，7.26(d，J=7.2 Hz，1H)，6.55(dd，J=9.6，2.4 Hz，1H)，6.46(d，J=2.4 Hz，1H)，6.09(s，1H)，3.39(d，J=7.2 Hz，4H)，2.80(s，6H)，1.09(t，J=7.2 Hz，6H)；MS m/z：515.3([M+Na]+，100)。

采用改进型的Ellman法测定了目标化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，活性结果如表1所示。

表1 目标化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性(100μmol/L)

a本测试平行3次，重复2次；b阳性对照，测试浓度为1μmol/L。

如表1所示，7-二乙氨基香豆素磺酰腙类衍生物对乙酰胆碱酯酶具有一定的抑制活性，在100μmol/L浓度下，3个目标化合物抑制活性分别达到32.6%，29.3%和26.1%，但都弱于阳性对照他克林。

3 结论

本文采用亚活性结构拼接的方法，以7-二乙氨基-4-甲基香豆素为原料，通过氧化、亲核反应，在香豆素母核上引入磺酰腙结构，合成了3个7-二乙氨基-香豆素类磺酰腙类衍生物，并进行了体外抑制乙酰胆碱酯酶活性测试。初步测试结果显示，目标化合物对乙酰胆碱酯酶具有一定的抑制活性。