循环肿瘤细胞在晚期食管鳞癌患者疗效评估中的临床价值*

李彦，胡正宇，李祥华，杨林

（安徽医科大学第一附属医院 1.肿瘤放疗科，2.普外科，安徽 合肥 230032）

中国是食管癌高发的国家，每年因肿瘤死亡的患者中，约有一半为食管癌患者[1]。食管癌是中国第5 大常见的肿瘤，也是病死率排名第4 的肿瘤[2]。对不具备手术指征的患者，同步放化疗为美国国立综合癌症网络（NCCN）指南中治疗的金标准[3]。患者的外周血中存在可自发扩散入血的肿瘤细胞，其已被定义为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTC）[4]，2007年美国临床肿瘤学会（ASCO）将CTC 纳入肿瘤标志物，可用于证实肿瘤的存在、发病过程、评估患者的预后、识别患者接受治疗后的临床治疗效果；2010年美国癌症联合委员会（AJCC）将CTC 作为远端转移标准[M 分期，cM0（i+）]。本研究通过监测食管鳞癌患者外周血中CTC 的动态变化，评估CTC 与患者预后的相关性，进一步研究CTC 是否可作为食管鳞癌患者疗效评估的指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年12月31 日—2016年12月31 日安徽 医科大学第一附属医院肿瘤放疗科的食管鳞癌患者38 例。其中，男性28 例，女性10 例；年龄46～90 岁，中位年龄72 岁。纳入标准：年龄≥20 岁的患者；经病 理或者细胞学确诊为食管鳞癌；患者自身情况不适宜手术，或术前评估病灶无法切除的Ⅲ期患者；出现远处寡转移的IV 期患者（任何T、N、M1、N3或T4b）；具有临床易于观察的可测量病灶；ECOG 评分≤2，无严重合并症及放疗禁忌证；患者可自行理解且自愿参加并签署知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤的患者；放化疗不耐受的患者；有严重的心肺肝肾功能障碍。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 治疗方案

1.2.1 放疗方案 仪器设备采用6 MV X 射线，使用西门子直线加速器行单纯三维适行放疗；所有入组患者的放疗总剂量为DT：50 Gy/25 F（d1-33），1.8～ 2.0 Gy/次；GTV 包括食管癌原发病灶及肿大的淋巴结，CTV 包含GTV 及淋巴引流区；PTV：在CTV 的基础上各外放0.5 cm，以及勾画出需保护的周围重要脏器。

1.2.2 化疗方案 本研究中入组患者均采用TP 方案：紫杉醇135 mg/m2第1 天静脉滴注；顺铂20 mg/m2第1～ 5 天；放疗第1 天予以第1个周期化疗，放疗20 次左右行第2个周期化疗，放疗结束后继续行2个周期巩固化疗，28 d 为1个化疗周期。

1.3 CTC 的检测

本研究采用阴性富集法外周静脉血中筛检CTC，对每位研究对象，在放疗前7 d 内，同步放化疗疗程结束后的7 d 内均用真空采血管采集肘正中静脉血，采集3.2 ml 静脉血于ACD 抗凝管中，采血完毕后立即颠倒 混匀8 次。采集的血液在24 h 内去除血清，裂解液去除 红细胞，磁珠孵育混匀去除白细胞，分离液分离富集的肿瘤细胞。使用CD45 抗体进行细胞免疫荧光检测，8 F 着丝粒探针（CEP8）进行免疫荧光原位杂交（imFISH），CEP ≥3/DAPI+/CD45-，也即核内信号≥3 倍体，细胞核 DAPI 染色阳性，CD45 染色阴性定义为循环肿瘤细胞；CEP=2/DAPI+/CD45+为白细胞。见图1。

图1 CTC 镜下视野

1.4 CTC 值及CTC、CEA、CA125、CA199 差值 的定义

CTC＞3个定义为CTC 阳性，CTC ≤3个定义为CTC 阴性[5-6]。放疗前后CTC 的差值dCTC=放疗前CTC-放疗后CTC，放疗前后CEA、CA125、CA199 的差值dCEA=放疗前CEA-放疗后CEA，dCA125=放疗前CA125-放疗后CA125，dCA199=放疗前CA199-放疗后CA199。

1.5 疗效评估

根据实体肿瘤的疗效评价标准RECIST 1.1 版，选取CT 所示食管病变最大层面的食管直径为靶病灶，评估食管癌患者同步放化疗前后靶病灶直径的变化[7]。

1.6 随访

对38 例患者进行放疗后维持2年的追踪随访。随访内容包括：体格检查，复查常规的血液学指标，颈、胸、腹部增强CT，依据检查结果评估患者是否复发。随访于2019年5月1 日截止。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较采用秩和检验（Z检验），患者生存率比较用Kaplan-Meier 法及Log-rankχ2检验，运用Cox 回归模型筛选影响预后的独立影响因素，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗前后CTC 和随访指标的变化

本研究中38 例患者接受50 Gy 的放疗剂量联合同步化疗后，靶病灶直径均明显缩小（P＜0.05），考虑50 Gy 的剂量即可达到临床缓解。放疗后的CTC、CEA、CA199、CA125 与放疗前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。放疗前后白细胞，血红蛋白，白蛋白和血小板差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤指标下降。见表1。

2.2 CTC 值与患者预后的生存分析

放疗前CTC 阴性患者与放疗前CTC 阳性的患者2年生存率比较，差异无统计学意义（χ2=2.743，P= 0.098）（见图2A）；dCTC＞0 与dCTC ≤0 患者生存曲 线提示两者2年生存率比较，差异有统计学意义（χ2= 10.844，P=0.001），即放疗后外周血CTC 数值未增加的 患者，预后较好（见图2B）。CEA、CA199、dCA125的取值对患者的预后无影响（见图2C、E、H）。放疗前CA125 值高于正常范围的患者预后明显优于CA125值低于正常范围的患者（χ2=15.989，P=0.000）（见图2G），dCTC、dCEA、dCA199、放疗前CA125 值对患者的2年生存率有影响。dCEA＞0，dCA199＞0 的患者生存期较dCEA ≤0，dCA199 ≤0 的患者生存期长（见图2D、F）。

表1 放化疗前后食管癌患者一般资料变化

图2 同步放化疗前后患者生存曲线比较

2.3 放化疗前后CTC 患者最大直径的比较

放化疗前后CTC 患者肿瘤最大直径比较，差异有统计学意义（P＜0.05），放疗前后CTC 阳性患者靶病灶最大直径大于CTC 阴性患者。见表2。

2.4 多因素Cox 回归分析

将dCTC＞0、CTC＞3、dCEA＞0、dCA199＞0、放疗前 CA125＞35 u/ml 值进行Cox 回归分析，结果显示dCTC＞0 是食管癌患者同步放化疗后预后的独立影响因素[=3.970（95% CI：1.043，15.117），P=0.043]，放疗前CA125＞35 u/ml 也是入组患者预后的独立影响因素 [=31.642（95% CI：2.939，340.656），P=0.004]。见表3。

表2 放化疗前后CTC 患者最大直径的比较

表3 同步放化疗后食管癌患者预后的多因素分析参数

3 讨论

对不能手术的食管癌患者，同步放化疗是治疗的金标准，根据2018年NCCN 指南，50.0～50.4 Gy 剂量即可达到根治剂量。王玉芳等[8]指出，配合足够剂量的紫杉醇联合放疗，50 Gy 组和60 Gy 组无生存差异，且高剂量组副反应较大，难以耐受后续化疗，故本研究予以入组患者的放疗剂量为50 Gy，放疗后患者靶病灶最大直径与放疗前比较，差异有统计学意义，考虑50 Gy 即可达到有效局控，患者的CTC 值同样有差异，即50 Gy 剂量，患者血液循环中的肿瘤细胞较治疗前明显减少，认为该治疗方案有效。

本研究发现食管癌患者经过50 Gy 剂量放疗，联合TP 方案同步化疗后，CTC 值较治疗前总体降低，与许刚等[5]对食管癌患者同步放化疗后CTC 值变化相致，LIU 等[9]对食管癌手术患者也有相同发现，手术患者术后和术后3 天外周血中CTC 的含量较术前都下降。再次验证50 Gy 的剂量即可改善患者病情，局部控制肿瘤进展，为有效的治疗。

国内外已有多项研究表明，CTC 与胸部肿瘤预后具有明显相关性[10-12]，对食管癌的患者，国内外相关文献提示CTC 可以作为判断食管癌预后的独立影响因素[13]。许刚等[5]认为，对食管癌患者放化疗前后的CTC 均与患者的预后密切相关，本研究结果提示食管癌放疗前CTC 与患者的预后相关性欠佳，经同步放化疗后，放疗前后CTC 的差值与患者预后明显相关，即食管癌局部晚期患者经同步放化疗后，CTC 值减少的患者预后较好，CTC 未见减少甚至增加的患者预后欠佳。经Cox 多因素分析显示，dCTC 为判断食管癌患者放化疗后预后的独立预后影响因素。CEA、CA199、dCA125 虽与患者的预后相关，但不能作为患者的预后独立影响因素，需结合其他指标共同判断。得到本结果的原因可能较放疗前CTC 的值，dCTC 更能体现治疗过程中CTC 值的动态变化，更能体现治疗在改善患者预后中的重要作用，即患者得到可改善预后的治疗后，CTC 值较前减少，预后得到改善。

本研究中的血清学指标CEA、CA125、CA199 均为消化道肿瘤的重要的肿瘤标志物，CA125 最早用于评估卵巢癌患者的复发及转移，同时也被多项研究指出可作为评估食管癌发生、发展的重要指标[14-15]。ZHAO 等[16]在其研究中指出CA125 可以预测食管鳞癌患者淋巴结的转移，血行转移，并是独立预后影响因素，且优于CA199 和CEA。在本研究中，通过对放疗前后肿瘤指标值的对比发现，放疗前CA125 值也可以作为食管癌患者同步放化疗后的患者预后的独立影响因素，与患者的预后密切相关。这可能与肿瘤细胞不仅可以合成CA125,且能主动将其分泌到细胞外相关[17]，仍需更大样本量及专项的研究探讨。

综上所述，放疗前后CTC 的差值，放疗前CA125值可作为食管癌III、IV 期接受同步放化疗治疗患者预后的独立影响因素，本实验仍有许多不足，纳入患者的样本量尚有限，目前正在入组更多的患者，更大样本的实验正在设计中，同时将对患者进行更长时间的随访，日后将进行更深一步的探讨。