HPLC同时测定决明子配方颗粒中2种成分

李正杰，张彦芬，柏艳柳，安丽娜，张永锋

（1.河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035；2.承德燕峰药业有限责任公司，河北 石家庄 050091）

决明子配方颗粒是由决明子药材加工成饮片后经提取、浓缩、干燥、制粒等制备而成，具有清热明目，润肠通便的功效。临床上常用于目赤涩痛，羞明多泪，头痛眩晕，目暗不明，大便秘结[1]。决明子主要有效成分为蒽醌类化合物，有降血脂、降血压、抑菌、泻下，润肠通便、抗诱变等作用[2-4]，主要以游离蒽醌和蒽醌苷衍生物形式存在。目前文献报道的蒽醌类含量测定主要是对大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素等的研究，采用的流动相多为乙腈、0.1 %磷酸溶液梯度洗脱的方法测定[5-8]，本研究首次采用乙腈、甲醇、0.1 %磷酸溶液，等度洗脱法同时检测决明子配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚的含量，相较于《中国药典》决明子项下流动相，降低了检测方法对泵的要求，更有利于企业对决明子配方颗粒制剂中橙黄决明素、大黄酚的含量测定，降低检测成本。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10AT高效液相色谱仪，配备SPDM20A二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器，LC-solution色谱工作站（日本岛津公司）；AT201电子分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 试药

决明子配方颗粒（批号：161001，161002，161003）；橙黄决明素对照品（中国食品药品检定研究院，批号111900-201202）；大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号1110796-201319）；乙腈、甲醇为色谱纯（Merck）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil100-5-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.1 %磷酸（49:7:44）；流速：1.0 ml/min；检测波长：222 nm；进样量：10 μl；柱温：30 ℃；理论板数按橙黄决明素峰计算应不低于3000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取橙黄决明素和大黄酚对照品适量，精密称定，加90 %甲醇制成每1 ml中含橙黄决明素8 μg、大黄酚4 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品约0.2 g，精密称定，置入具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（20:1）混合溶液25 ml，称定重量，80 ℃水浴加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3 ml，置入10 ml 量瓶，加2 %氢氧化钠溶液1.5 ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取甲醇-盐酸（20:1）混合溶液作为空白溶剂。分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。供试品溶液的色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且空白溶剂无干扰。

图1 HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察 取浓度为6.16 μg/ml橙黄决明素和浓度为5.24 μg/ml大黄酚混合对照品溶液，分别进样2，5，10，15，20，25 μl，测其峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得橙黄决明素回归方程为Y=3339.7X-225.71（r=0.999 99），大黄酚回归方程为Y=8473.9X-1530.2（r=0.999 99）。结果表明，橙黄决明素和大黄酚分别在进样量为12.32～154 ng，10.48～131 ng范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液与供试品溶液，按2.1项下色谱条件，各连续重复进样5次，分别测定峰面积，得对照品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.19 %，0.13 %（n=5）；供试品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.12 %，0.08 %（n=5）。结果表明，仪器的精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 吸取橙黄决明素、大黄酚对照品溶液及供试品溶液，分别在室温放置入0，1，2，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，测得对照品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.22 %，0.27 %（n=6）；供试品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.04 %，0.15 %（n=6）。结果表明，对照品溶液与供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批样品（批号：160501）6份，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，测得橙黄决明素平均含量为3.420 mg/g，RSD为0.56 %（n=6）；大黄酚平均含量为2.503 mg/g，RSD为0.47 %（n=6）。结果表明本方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取已知含量的同一批样品（批号：160501）6份，各约0.1 g，精密称定，分别精密加入浓度为14.59 μg/ml橙黄决明素对照品溶液25 ml和浓度为10.32 μg/ml大黄酚对照品溶液25 ml，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率；结果得橙黄决明素的平均回收率为99.88 %（n=6），RSD为0.75 %；大黄酚的平均回收率为101.07 %（n=6），RSD为0.10 %。结果见表1、表2。

2.3.7 耐用性试验 为考察色谱柱对测定成分的分离情况，进行色谱柱耐用性试验，即取同一供试品选用不同生产厂家、不同型号的色谱柱按2.1项下色谱条件进行测定，结果橙黄决明素平均含量是3.402 mg/g，RSD是0.48 %；大黄酚平均含量是2.501 mg/g，RSD是0.40 %；且在不同色谱柱上，待测定成分峰分离良好。结果表明，此法耐用性符合要求。

2.4 含量测定

取3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样测定，计算橙黄决明素和大黄酚的含量，结果见表3。

表1 橙黄决明素回收率测定结果

表2 大黄酚回收率测定结果

表3 橙黄决明素、大黄酚测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择

中国药典2015年版一部决明子药材项下是以橙黄决明素和大黄酚为检测指标，以乙腈为流动相A，0.1 %磷酸为流动相B，采用梯度洗脱，以284 nm为检测波长，测定含量，梯度运行时间表是40 min，以乙腈-甲醇-0.1 %磷酸（49:7:44）为流动相，采用等度洗脱，在30 min内同时测定橙黄决明素与大黄酚，所测定的色谱峰与相邻峰的分离度都达到1.5以上，此流动相方便、省时。

3.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器，对橙黄决明素和大黄酚的色谱峰分别进行光谱扫描，结果表明：橙黄决明素最大吸收峰在285 nm处（见图2）；而大黄酚有3个吸收峰，在225，257和287 nm，其中225 nm处的色谱峰最灵敏（见图3）。

从两成分的检出灵敏度、检测成本及操作的便利性考虑，采用二极管阵列检测器，对同一针样品，分别在222，285和254 nm波长下，进行检测，结果见表4。

图2 橙黄决明素光谱扫描图

图3 大黄酚光谱扫描图

表4 同一供试品在不同检测波长下的两成分含量比较

从两成分的含量来看，两种成分含量相差不大，在222 nm进行检测，两峰的检出灵敏度均较好，所以选择222 nm作为橙黄决明素和大黄酚的检测波长。

3.3 供试品溶液的制备

比较了提取溶剂的水解酸度、回流水解的提取时间对橙黄决明素、大黄酚含量的影响，结果表明，采用甲醇:盐酸（20:1）为提取溶剂，80 ℃水浴回流水解30 min时，橙黄决明素、大黄酚含量最高。

3.4 供试品溶液制备方法与药典制备方法的比较

参考中国药典决明子项下制备方法，对决明子配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚含量进行测定，并与选定的供试品溶液制备方法进行比较，发现二者测得橙黄决明素、大黄酚的含量相差不大，而选用的制备方法既减少了有毒溶剂三氯甲烷的使用，又节约了供试品溶液制备时间，降低了检验成本。

综上所述，本文采用HPLC测定决明子配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚含量，方法简便易行，重现性好，可用于决明子配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚的质量控制。