ω-3不饱和脂肪酸DHA改善β淀粉样蛋白沉积致AD的小鼠模型记忆功能的机制研究

陆 冰，刘 洲，郑锡峰，刘广雁，林智君，陈秋萍

阿尔茨海默病(Alzheimer diseasa，AD)即老年性痴呆，是一种最为常见的神经系统退行性疾病，临床主要特征表现为失认、失语、记忆障碍、执行功能障碍、视空间技能损害和行为改变等。目前，β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)假说是广泛认可的AD发病机制[1]，Aβ1-42是一种常用的Aβ亚型，具有毒性强、易聚集等特点，可使Aβ斑块沉积引起神经毒性，造成突触损伤和神经元死亡，进而引发AD，多用于AD小鼠模型的建立。目前，临床上仍无治疗AD的特效药物。随着我国老龄化的加剧，AD越来越受到科学研究领域的关注和重视，寻找和研发改善AD患者认知功能、延缓疾病进展的新药物对AD患者的治疗具有重要意义。

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是深海鱼油和微藻油的主要成分，隶属ω-3不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3PUFA)。DHA作为一种天然的长链多不饱和脂肪酸，具有保护视网膜、促进生长发育、防治心血管疾病、抗癌、抗炎、延缓衰老、预防老年痴呆等重要作用[2]，在机体代谢合成和生理病理过程中发挥着重要作用[3]。有研究指出，在老年人群脑内ω-3多不饱和脂肪酸丢失严重，摄入DHA有降低AD风险和改善大脑记忆障碍的作用[4～7]。然而，目前DHA改善AD记忆功能的机制并不明确，研究DHA改善AD记忆功能的作用机制对DHA延缓和治疗AD的临床应用具有重要意义。因此，本研究通过建立AD小鼠模型的方式，以DHA灌胃后观察其对神经炎症因子及相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器 SD健康雄性小鼠36只，体重21～27 g，月龄6 m，购于广东省实验动物中心；Aβ1-42和DHA购于美国Sigma公司；辣根酶HRP标记抗鼠或抗兔IgG(IgG-HRP)、脑源性神经营养因子(BDNF)抗体、干扰素-γ(IFN-γ)抗体、核转录因子-κB(NF-κB)抗体购于美国Santa Cruz公司；RIPA裂解液和BCA蛋白质定量测定试剂盒购于上海碧云天公司；ELISA试剂盒购于美国R&D公司；Morris水迷宫测试系统购于深圳瑞沃德公司；脑立体定位仪购于成都仪器厂。

1.2 Aβ致AD小鼠模型的建立及分组 采用Aβ-intrahippocampal injection方法：首先，将Aβ1-42溶于NH4OH(浓度1%)和无菌三蒸水，使其工作浓度为2 μg/μl，制备寡态Aβ1-42；将小鼠麻醉后，使用固定仪将头颅固定，去毛后沿正中切口，剥皮暴露前囟；选择前囟后2.2 mm，中线左右旁开1.7 mm，硬脑膜下2.0 mm，采用体积为25 μl微量进样器，向小鼠左侧侧脑室中注射2 μl寡态 Aβ1-42生理盐水；待注射完毕后留针2 min；缓慢拔针后，缝合切口；于切口处涂青霉素粉末；待小鼠清醒，将其放回笼内。将注射Aβ1-42的小鼠分为Aβ模型组和Aβ+DHA组，注射生理盐水的小鼠记为假手术组。每组小鼠均12只，于次日，采用灌胃方式给药，Aβ+DHA组小鼠每天以DHA按照300 mg/kg剂量灌胃，而Aβ模型组和假手术组给予等量的羧甲基纤维素钠灌胃，连续3 w后，开展后续实验。

1.3 Morris水迷宫实验 在上述各组小鼠给药15 d后，于次日开始进行定位航行实验和空间探索实验：定义小鼠从放入水中(面壁腹部朝下)到找到平台所需时间为潜伏期，如果小鼠未能在规定时间内(60 s)找到平台，则应给以引导。所有小鼠在平台的停留时间为15 s，实验重复3次，连续训练5 d。在实验结束1 d后，撤掉平台。按照原位置投放小鼠，观察并记录小鼠在60 s内的游泳路径，以及穿越原平台所在地点的次数。

1.4 尼氏染色 上述实验结束1 d后，进行尼氏染色：每组小鼠随机选取5只，先以生理盐水进行心脏灌流；麻醉处死后，分离大脑，并用4%多聚甲醛进行固定；经液氮冷冻后，采用冷冻切片机切取海马部位，作海马结构冠状面连续切片(厚度5 μm，每50 μm取片)；冲洗后，经梯度酒精(50%、70%、80%、90%)脱水、透明、浸蜡、包埋和切片后制成石蜡切片；将切片置于载玻片上，滴加焦油紫染液，常温下反应15 min后，以95%酒精进行分色，显微镜下观察并控制染色；再经酒精梯度脱水和二甲苯透明后，以中性树胶封片；观察各组小鼠海马神经元的尼氏染色情况，200倍显微镜下统计单位面积的阳性细胞个数。

1.5 ELISA检测海马炎症因子TNF-α、IL-16检测 各组随机选取5只小鼠，断头取海马组织，按照ELISA试剂盒说明书检测海马炎性因子TNF-α和IL-16的含量。

1.6 Western blot检测海马BDNF、IFN-γ、NF-κB蛋白检测 取上述实验中的海马组织，以RIPA裂解液提取总蛋白，以BCA试剂盒定量：取蛋白样品50 μg，加5 μl 5×loading buffer混匀，沸水浴变性5 min，离心，上样至12% SDS-PAGE凝胶中电泳，其中，浓缩胶和分离胶的电压分别为80 V和120 V恒压；终止电泳后，取蛋白转印至PVDF膜；经TBST漂洗后，以脱脂奶粉-TBST封闭液处理2 h；37 ℃下，与用TBST 500倍稀释的BDNF、IFN-γ、NF-κB和β-actin抗体4 ℃反应过夜；次日洗膜后，加入TBST 1000倍稀释HRP-IgG二抗，常温下孵育1.5 h；洗膜后，滴加ECL试剂显色；采用Gel-Pro Analyzer 6.0凝胶定量软件分析BDNF、IFN-γ、NF-κB蛋白条带灰度，以目的蛋白与β-actin蛋白的灰度值表示相对表达量。

2 结 果

2.1 DHA对Aβ致AD小鼠记忆功能的影响 记录5 d内的小鼠航行，定位小鼠的潜伏期和穿越平台的次数，结果(见表1)。与假手术组相比，Aβ模型组和Aβ+DHA组小鼠的潜伏期显著延长(P<0.05)，而Aβ+DHA组潜伏期较Aβ模型组小鼠有所降低(P<0.05)；同时，注射Aβ后小鼠穿越平台的次数较假手术组显著减少(P<0.05)，而在注射Aβ基础上给予DHA后，穿越次数又有所增加(P<0.05)。可见，DHA能够改善Aβ所致AD小鼠的记忆功能障碍。

2.2 DHA对小鼠海马神经元的影响 注射Aβ的小鼠海马神经元有大量缺失，尼氏染色阳性细胞数所减少，与假手术组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；在注射Aβ基础上给予DHA灌胃后，尼氏染色阳性细胞数较Aβ模型组显著增多(P<0.05)。结果反映了DHA可以改善Aβ注射后引起的神经元损伤(见表2)。

2.3 DHA对Aβ致AD小鼠海马TNF-α、IL-16含量 与假手术组比较，Aβ模型组和Aβ+DHA组小鼠海马组织中TNF-α和IL-16含量显著升高，统计学分析差异有显著性(P<0.05)；给予DHA灌胃后，海马组织中TNF-α和IL-16含量较Aβ模型组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示，DHA对Aβ致AD小鼠功能障碍的改善作用与下调TNF-α和IL-16含量有关(见表3)。

2.4 DHA对Aβ致AD小鼠海马BDNF、IFN-γ、NF-κB蛋白的表达 不同小组中小鼠海马组织中BDNF、IFN-γ、NF-κB蛋白的表达存在差异，注射Aβ后，BDNF蛋白表达水平降低，而IFN-γ和NF-κB蛋白表达水平升高，与假手术组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；在注射Aβ并给予DHA干预后，由Aβ引起的BDNF蛋白表达降低、IFN-γ和NF-κB蛋白表达升高的结果受到减弱。表明，DHA可促进BDNF蛋白表达，抑制IFN-γ和NF-κB蛋白表达(见图1、表4)。

表1 DHA对Aβ致AD小鼠潜伏期及穿越平台次数的影响

与假手术组相比*P<0.05；与Aβ模型组相比#P<0.05

表2 各组小鼠神经元的尼氏染色阳性细胞数比较

与假手术组相比*P<0.05；与Aβ模型组相比#P<0.05

表3 各组小鼠海马组织中TNF-α和IL-16含量的比较

与假手术组相比*P<0.05；与Aβ模型组相比#P<0.05

表4 各组小鼠海马组织中BDNF、IFN-γ、NF-κB蛋白的相对表达量

与假手术组相比*P<0.05;与Aβ模型组相比#P<0.05

图1 Western blot检测各组小鼠海马组织中BDNF、IFN-γ、NF-κB蛋白的表达结果

3 讨 论

AD是一种隐匿性慢性疾病，其发病前在临床前期表现为轻度认知障碍。调查数据显示，每年在有轻度认知障碍的65岁以上老年人中AD的发病率占到95‰[8]。已步入老龄化的我国，到2053年之前老年人口规模将不断攀升，AD的发病率也有上升的趋势，这将为家庭和社会带来巨大的负担，严重影响着我国人们的生活质量[9,10]。因此，改善AD患者认知障碍药物的研究一直是医学研究领域的热点。DHA广泛存在于多种海洋生物中，在延缓和改善AD记忆功能方面具有很好的作用，是一种很有潜力的治疗和改善AD的药物[5]。本研究通过注射寡聚态Aβ1-42建立AD小鼠模型，探讨DHA对小鼠记忆功能的影响。结果发现，DHA可改善Aβ1-42所致AD小鼠的记忆功能障碍和神经元损伤。此结果进一步验证了王佳等[11]关于DHA改善AD学习记忆实验结果。

近年来，越来越多的证据表明，炎症反应是Aβ造成神经毒性引发AD的主要致病原因之一[12～14]。处在AD脑内神经元损伤部位的小胶质细胞可以不断被激活，产生大量如IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ等炎症因子，进而引发脑内的炎症反应[15]。本研究通过检测DHA干预后AD小鼠模型中TNF-α和IL-16的含量变化，BDNF、IFN-γ、NF-κB联蛋白表达来探讨和评估DHA对改善AD记忆功能障碍的分子机制。结果显示，DHA可抑制Aβ1-42所引起的TNF-α和IL-16含量上升；进一步检测炎性因子IFN-γ蛋白的表达发现，Aβ1-42所引起IFN-γ蛋白升高也受到抑制。此结果与陈祥荣等[16]得出DHA能够降低小胶质细胞介导的中枢性炎症反应中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子的表达结果相吻合。提示，DHA可能通过抑制小胶质细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-16和IFN-γ等改善AD功能障碍。BDNF是神经营养家族中的重要成员，在维持神经元生长和损伤后修复方面发挥着重要作用，低水平的BDNF与AD的发生发展关系密切[17]。NF-κB联是一种重要的转录调节因子，在胶质细胞介导的神经炎症中发挥着重要作用[18]。研究结果显示，DHA还可以促进BDNF和抑制NF-κB联蛋白表达，提示，DHA可能通过上调BDNF表达改善神经元的损伤，抑制NF-κB联信号通路激活介导AD的炎症反应。

综上所述，DHA可以改善Aβ1-42致AD小鼠模型记忆功能障碍，其作用机制可能与降低海马组织中TNF-α和IL-16含量，抑制IFN-γ和NF-κB联蛋白表达，促进BDNF蛋白表达有关。这一结果为DHA治疗AD记忆功能障碍的临床应用提供了新的理论依据。