恶劣环境下异养硝化-好氧反硝化菌的研究进展

邹玉兰 ，王 莹 ，陈 虎 ，吕永康

（1.太原理工大学煤科学与技术教育部和山西省重点实验室，山西太原030024；2.太原理工大学环境科学与工程学院环保产业创新研究院，山西太原030024）

工农业废水中氨氮的超标排放导致水体富营养化，严重威胁人类的生产生活和生态平衡〔1〕。因此，减少工农业污水排放的氨氮含量尤为必要。近年来，生物法处理氨氮因具有成本低、二次污染少等优点而被广泛使用〔2〕。传统生物脱氮过程主要由好氧自养硝化和厌氧/严格缺氧异养反硝化两部分构成〔3〕。传统生物脱氮的两部分工艺对有机底物和氧气的需求截然不同，导致操作复杂化和处理成本增加。1985年研究人员发现了一株具有异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）能力的脱氮副球菌 Paracoccus denitrificans〔4〕，并首次提出 HN-AD 的概念。 HN-AD 作为一种新型的生物脱氮技术，能够在好氧条件下利用有机碳源，同时将氨氮彻底转化为N2，实现COD和氮源的同步脱除，并克服了传统脱氮过程中严格厌氧条件难以控制的限制。而HN-AD菌作为该项技术的主要参与者和完成者被陆续分离，如贪铜菌属Cupriavidus sp.S1〔5〕、不动杆菌 Acinetobacter sp.JR1〔6〕和假单胞菌属 Pseudomonas balearicastrain RAD-17〔7〕等。据研究报道，HN-AD菌相比于传统生物脱氮技术具有如下优良特性：（1）反硝化过程产生的碱能部分中和硝化过程产生的酸〔8〕；（2）可利用有机底物作为能源，使得异养硝化菌的繁殖速度远高于自养菌〔9〕，提高了对含氮污染物的降解速率并能同时脱氮除碳；（3）硝化和反硝化可在同一反应器和好氧条件下同时进行〔10〕，因此该过程基本无硝酸盐和亚硝酸盐的积累。前人研究表明，大部分HN-AD菌在相对温和（如pH为7、温度为30℃和低盐度）的条件下发挥作用〔11〕。而实际废水成分复杂，使得该类细菌很难发挥良好的脱氮特性，严重限制了其在实际废水中的应用。近年来为提高HN-AD菌的实际应用性能，学者们将HN-AD菌在复杂环境条件下的脱氮性能作为研究重点。因此，笔者总结了在极端pH、温度、重金属、难降解有机物和盐度等恶劣环境下HN-AD菌的脱氮性能，并阐述了其在污水处理中的研究现状及面临的问题。

1 不同恶劣环境下HN-AD菌的脱氮特性

1.1 极端pH

大多数HN-AD菌倾向于在中性或微碱性环境下生长，当pH超过菌株的适应范围时会降低菌株对营养物质的吸收和酶活力，使微生物的生长受到抑制，进而影响菌株的脱氮性能。近年来有学者筛选出可耐受极端pH的HN-AD菌，以适应不同酸碱性的实际废水。Jingrui Yang等〔6〕从酸性制药废水中分离出不动杆菌Acinetobacter sp.JR1，并对其在酸性条件下（pH=4.5）的脱氮性能进行研究，结果表明当初始pH为4.5、氨氮为103 mg/L时，总氮（TN）去除率高达97.9%；此外，JR1在pH为4.5～10范围内表现出较好的脱氮性能，TN去除率高达96%。耐碱异养硝化菌 Serratia marcescens W5〔12〕在 pH 为 10 时经24 h培养后，氨氮去除率仍可达80%以上。Maoxia Chen等〔13〕从实验室反应器的活性污泥中分离出一株HN-AD菌Aeromonas sp.HN-02，其抗酸碱pH范围达2.3～11，且当pH在4～10时对应的氨氮去除率高达70%。这些HN-AD菌能够在极端pH环境下生长并进行脱氮的可能原因为：（1）偏酸性条件下，HN-AD菌在反硝化过程中逐渐产碱进而缓解偏酸的情况；（2）在偏碱性条件下含有更多的游离NH3，从而有利于异养硝化〔14〕。

1.2 温度

目前HN-AD菌脱氮的最适温度范围大都在25～37℃，而对于高纬度地区的中国北部、加拿大和北欧等地，每年水环境温度低于10℃的时间长达4个月。以中国哈尔滨市的主要水源松花江为例，冬季水温可降至1℃，水温在1～10℃范围内可持续6个月左右〔15〕。因此，该类地区低温脱氮菌的研究成为研究热点。Mo Yang等〔16〕从中国北部松花江中分离出耐低温的詹森菌属Janthinobacterium sp.M-11，在2℃、碳氮比为5、初始氨氮为5 mg/L时氨氮去除率可达98%，表明该菌株具有低温脱氮能力，且养分消耗低。Zejia Zheng等〔17〕从中国北部松花江中分离出可耐低温（2℃）的不动杆菌Acinetobacter harbinensis HITLi7T，当初始质量浓度为5 mg/L时，氨氮和硝酸盐的最大降解速率分别为 0.076、0.029 mg/（L·h）。Yi Xu 等〔18〕研究发现假单胞菌 Pseudomonasputida Y-9在15℃时能够有效降解氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮，当氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮初始质量浓度分别为 208.94、205.63、205.32 mg/L 时，对应的去除率为 98.3%、74.7%、85.6%，且平均降解速率可达2.85、1.60、1.83 mg/（L·h）。 该类 HN-AD 菌的耐冷机制可归为：（1）代谢途径的调节、蛋白质的合成和蛋白质的再折叠〔19〕；（2）低温下 HN-AD 菌应激相关基因的表达增加〔13〕；（3）细胞产生抗氧化酶以提高菌株的耐冷性〔20〕。

近年来，一些耐高温菌株也被分离出来。张苗等〔21〕从燃煤电厂生物滴滤器的生物膜中分离出耐高温菌Chelatococcus daeguensis TAD1，当培养温度为50℃、初始硝酸盐为63.79 mg/L时，TAD1经24 h可降解硝酸盐，去除率可达99.12%，且未检测到中间产物亚硝酸盐的积累。G.Mével等〔22〕从深海热液喷口分离出芽孢杆菌Bacillus MS30，经研究观察到65℃时硝化活性最佳。这些菌株在高温时具有较好的脱氮性能，其耐高温机制可归为：与底物去除有关的酶活性增加〔23〕；高温下产生更多的游离氨，有利于异养硝化〔6〕。

1.3 重金属

在一些冶金、电镀、印染和制革等工业废水中含有 Cu2+、Zn2+、Cr6+、Ni2+等大量重金属，会影响 HN-AD菌的脱氮性能。Jingrui Yang等〔6〕研究发现Cu2+为5 mg/L时仅有8.80%的氨氮被不动杆菌Acinetobacter sp.JR1降解，至Cu2+增加到10 mg/L时，菌株JR1不能生长从而无法降解氨氮。Maoxia Chen等〔13〕研究发现Aeromonas sp.HN-02对Cu2+极为敏感，Cu2+为1.5 mg/L时几乎完全抑制了该菌株的生长。而于大禹等〔24〕发现向模拟废水中添加Cu2+对异养硝化关键酶有促进作用。Ni Zhang等〔25〕研究发现假单胞菌Pseudomonas putida ZN1能够耐受较高浓度的Cu2+，Cu2+为800 mg/L时氨氮去除率仍可达62.10%，菌株ZN1中抗铜基因copB-I的成功扩增可解释其对Cu2+的高耐受性。从垃圾填埋场渗滤液处理反应器中分离的假单胞菌P.aeruginosa PCN-2可同时去除Cr6+和硝酸盐，且扩增出Cr还原基因ChrR，进而证实该性能〔26〕。 Zhiyi Sun 等〔5〕研究发现在 10 mg/LCr6+冲击下Cupriavidus sp.S1已完全停止生长，无法实现水中氮的脱除。综上，不同菌种具有不同的重金属耐受性。微量重金属可作为微生物生长必需的微量元素，而过量的重金属会严重抑制微生物的生长〔5〕。目前HN-AD菌的抗重金属性能主要归因于：（1）金属离子可通过共价作用催化酶的亲电子中心，成为酶的辅基，进而激活酶的催化能力〔24〕；（2）HN-AD 菌具有相关金属抗性基因，在特定环境中可编码相应的金属抗性蛋白〔25〕；（3）HN-AD 菌同时存在相关金属和氮的还原基因〔26〕。

1.4 难降解有机物

众所周知，来自于焦化、制药、石油等行业的废水含有喹啉、吡啶、苯酚等难降解有机物，因此常规的微生物处理往往受难降解有机物毒性的影响而导致微生物的生长生理机能受抑制，最终抑制该类废水的生物脱氮。近年来，一些研究者致力于分离可耐受难降解有机物的菌株，发现一些HN-AD菌可通过共代谢作用降解苯酚、吡啶、硝基酚、喹啉和抗生素等难降解有机物。Yaohui Bai等〔27〕分离出以吡啶为唯一碳氮源的新菌株Shinellazoogloeoides BC026，在45.5 h内可将1 806 mg/L吡啶完全降解，且只要提供足够的额外碳源，就能快速将中间产物氨氮彻底转化为N2；其课题组又分离出一株以喹啉为唯一碳氮源的假单胞菌Pseudomonas sp.〔28〕，根据产物分析和相关基因的扩增证明该菌株也可进行HN-AD过程。黄杆菌Diaphorobacter sp.PD-7〔29〕以初始质量浓度为1 400 mg/L的苯酚和120.69 mg/L氨氮分别作为唯一碳氮源时，氨氮在75 h内几乎被完全降解，平均降解速率为 1.61 mg/（L·h），苯酚在 85 h内降解完全；相同条件下硝酸盐为唯一氮源时，65 h内硝酸盐去除率达91%，平均降解速率达到1.61 mg/（L·h），苯酚也可在85 h内被完全降解。红球菌Rhodococcus pyridinivorans GF3〔30〕从 1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸污染土壤中被分离出来，在150 r/min和30℃下可降解9种蒽醌类化合物ACs，且能同步脱除ASA-2和硝酸盐。此外，制药废水中存在常见的难降解抗生素类有机物，其广谱抑菌性能使得该类废水的生物治理更加困难。嗜铬杆菌Ochrobactrum sp.KSS10〔31〕可降解氧四环素（OTC）、氨氮和硝酸盐，使OTC从19.25 mg/L急剧降至4.63 mg/L，氨氮和总氮降解速率分别为 0.848、1.189 mg/（L·h），且硝酸盐最大降解速率达 1.967 mg/（L·h），表明菌株 KSS10 可通过共代谢作用降解抗生素和无机氮。Achromobacter sp.JL9〔32〕可降解低碳氮比制药废水中的磺胺甲恶唑（SMX）和氮，且SMX生物降解率和脱氮率分别为90.4%（SMX）、92.4%（硝酸盐）、86.7%（氨氮）和89.4%（总氮）。不同的菌株具有不同有机物耐受降解性能，HN-AD菌能够同时降解有机物及氨氮的主要机制在于：（1）HN-AD菌中同时存在有机物和氮降解基因〔29〕；（2）有机物降解过程中相关键的断裂促进了细菌代谢和氮转化〔31〕；（3）有机物降解过程产生腐殖酸和色氨酸蛋白，有助于HN-AD菌降解氮和有机物〔31-32〕。

1.5 盐度

目前关于HN-AD菌的分离基本源于淡水或污泥，而来自于海水养殖、食品加工、石油生产、制革和制药厂等许多工农业的废水往往具有高盐度的特点〔14，33-34〕。 因此，嗜盐 HN-AD 菌的筛选及脱氮性能研究成为国内外研究者的主要关注点，为生物强化实现高盐废水脱氮成为可能。Jinming Duan等〔14〕从海洋沉积物中分离出Vibrio diabolicus SF16，在初始氨氮为119.77 mg/L、盐度为1%～5%的范围内，氨氮去除率可达92%以上，且盐度升至7%时氨氮去除率仍可达74.68%。Kun Zhao等〔33〕从虾培养池中分离获得Bacillussubtilis H1，盐度为30 g/L时最有利于该菌生长和脱氮，且氨氮和亚硝酸盐去除率分别达到87.2%、89.4%。 Dan Li等〔34〕从制革废水中分离出克雷伯氏菌Klebsiella sp.TN-10，并研究其在不同NaCl质量浓度下（0、15、25、35 g/L）的生长和硝化特性，研究发现 NaCl为 0、15、25、35 g/L 时的最大生物量分别为 2.59、2.15、2.18、1.89，且最大氨氮去除率分别为 99.73%、99%、98.08%、98.27%。 Te Wang 等〔35〕从盐池沉积物中分离出Halomonas sp.B01，在NaCl质量浓度为60 g/L、初始氨氮为2 121 mg/L时，96 h内氨氮去除率可达98.8%。白洁等〔36〕从海底沉积物中分离出Zobellella sp.B307，在盐度为5～75 g/L条件下生长良好且有稳定的脱氮性能，氨氮和硝酸盐氮的去除率均在94%以上。研究表明，适量的盐度有利于调节微生物体内的渗透压，使细胞内渗透压与环境渗透压相近，进而为微生物生长提供良好的环境。但盐度过高将会引起渗透压过高，破坏细菌细胞使细胞中的水分过度损失及原生质体分离，最终抑制微生物的代谢活动，包括与脱氮相关的代谢活性〔37〕。但以上分离出的HN-AD菌具有耐盐特性，主要归因于以下方面：（1）细胞通过产生抗氧化酶来对抗高盐的冲击，能催化清除超氧阴离子自由基，从而提供抗氧毒性的防御〔34-35〕；（2）HN-AD 菌 通过 合成 相容溶质对细胞内大分子起保护作用〔35〕；（3）微生物生长和氮去除的相关酶具有耐盐性〔35〕。

1.6 其他恶劣环境条件

除上述环境因素外，研究者还发现可耐受高氨氮负荷、低碳氮比和硫化物的HN-AD菌，如Zobellella taiwanensis DN-7〔38〕可将 1 000、2 000 mg/L 的氨氮分别在96、216 h内降解完全。Janthinobacterium svalbardensis F19〔39〕在碳氮比仅为 2且初始 pH 为10条件下，能够有效降解氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐和羟胺，去除率分别为 96.44%、92.32%、97.46%和96.69%。 Y.D.Jaffer等〔40〕研究了嗜唾液菌 Paracoccus saliphilus strain SPUM同时HN-AD和硫氧化工艺，经过24 h培养，硝酸盐和亚硝酸盐的最大去除量分别为（14.17±0.31）、（11.22±0.31） mg/L，12 d 后硫酸盐-硫的产量为（190±4.3）mg/L。这些能在恶劣环境下生长且能表现出良好脱氮性能的HN-AD菌的发现，为恶劣环境下含氮废水的处理提供了良好的菌种资源。

2 恶劣环境下HN-AD菌在废水处理中的应用

在恶劣环境下分离获得的具有良好脱氮性能HN-AD菌的实际应用引起了部分研究者的关注，尽管相关应用研究主要处于实验室规模，通过人工接入优势菌种可达到强化模拟废水生物脱氮的目的。耐盐菌 Vibrio diabolicus SF16〔14〕直接投加到曝气生物滤池中处理高盐含氮废水时，氨氮和总氮的去除率分别达97.14%、73.92%。在垂直流人工湿地系统中投入耐盐脱氮菌 Zobellella denitrificans strain A63〔41〕，对氨氮、硝酸盐和总氮的去除率分别达79.2%、98.7%和89.9%。通过接种假单胞菌Pseudomonas sp.HJ3〔42〕建立生物强化系统，对煤气化废水进行同时脱氮除酚性能研究，结果发现该系统对氨氮、总氮和苯酚的去除率分别可达（67.07±0.76）%、（57.95%±0.12）%和（74.91±0.33）%。 Ying Wang 等〔43〕利用大孔树脂和粪产碱菌Alcaligenes faecalis strain WY-01建立了吸附-释放-生物降解系统来降解氨氮和高浓度苯酚，该体系中WY-01可将高达6 000 mg/L的苯酚降解完全，且初始质量浓度为384 mg/L的氨氮去除率可达（99.03±3.95）%。Bin Zhao等〔44〕采用施氏假单胞菌P.stutzeri strain XL-2强化序批式生物膜反应器处理高氨氮废水，结果表明菌株XL-2的加入使脱氮效率提升了10%左右，且中间产物硝酸盐和亚硝酸盐的积累量明显减少，进而大幅提升总氮去除率。

3 结语与展望

HN-AD菌能在利用有机碳源的同时，在单一有氧条件下实现同步硝化反硝化。为提高HN-AD菌的实际应用性能，学者们将HN-AD菌在复杂环境条件下的脱氮性能作为研究重点。一方面，在极端pH、温度、重金属、难降解有机物和高盐等恶劣环境下筛选获得多种HN-AD菌株，这些菌株表现出较好的脱氮性能，甚至可实现难降解有机物的同时去除。HN-AD菌株自身的酶活特性及相关基因表达为其耐受恶劣环境的主要原因。另一方面，不同环境下的优势HN-AD菌可通过人工接入废水处理系统来达到生物强化某类废水处理的目的，并在实验室水平取得一定强化效果。HN-AD菌株在不同极端环境下的生长及脱氮特性，表明它们在废水处理方面有良好的发展潜力，提高了生物脱氮效率。

目前HN-AD菌的研究主要处在实验室规模，鲜有对实际废水处理的报道。今后的研究可围绕以下方面展开：

（1）利用分子生物学对恶劣条件下HN-AD菌的脱氮机理进行深入研究。

（2）目前大部分研究是基于单个恶劣条件下进行，接下来应开展2个或多个恶劣条件下对HN-AD菌脱氮性能的影响研究。

（3）研究不同菌属甚至相同菌属的HN-AD菌对环境条件耐受性不同的原因。

（4）加强对HN-AD工艺技术方面的研究，使其尽快投入到实际废水处理中。