SerpinB6b 在大鼠着床期子宫及蜕膜的表达与调控

腾瑶瑶，李世杰，马兴红

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

大鼠早期妊娠通常是指妊娠第1～9 天，大鼠交配后检测到阴道栓，即为妊娠第1 天。早期妊娠包括受精、着床前胚胎发育、胚胎着床和蜕膜化等几个关键事件。胚胎着床是胚胎经历定位、黏附和侵入，最终植入于子宫内膜的过程[1]，其关键在于活化的胚胎与处于“接受态”的子宫密切合作，而该过程受到卵巢分泌的类固醇激素、细胞因子、黏附分子和酶类等多种因素的调节[2]。大鼠胚胎着床发生在妊娠第6 天，在着床过程中，胚胎周围的基质细胞进行广泛增殖与分化，转变为蜕膜细胞，这一过程被称为子宫基质细胞蜕膜化[3]。蜕膜化异常会导致妊娠失败[2]，因此妊娠过程中蜕膜化至关重要。

丝氨酸蛋白酶抑制剂亚家族成员B（Serine Peptidase Inhibitor，Clade B，SerpinB）有15 个成员，其成员SerpinB6 是由白细胞、血小板、内皮细胞等产生的一种胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂[4]。Charron 等[5]研究发现，SerpinB6 在小鼠性腺生殖细胞中有表达。本实验室前期研究发现，SerpinB6b（SerpinB6 成员之一）的表达与小鼠胚胎着床及蜕膜化相关[6]，但SerpinB6b在大鼠围着床期子宫中的表达和作用机制尚无报道。本研究采用原位杂交、荧光定量PCR、免疫组织化学和蛋白质印迹分析等方法检验SerpinB6b在大鼠早期妊娠1～9 d、人工诱导蜕膜化及体外诱导蜕膜化模型子宫中的表达规律，探究SerpinB6b的功能。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验所采用的模式动物为性成熟的SD品系大鼠，约6～12 周龄，购买自黑龙江中医药大学。人工控制饲养环境为室温22℃，光照时间为07:00—19:00，自由采食及饮水。

1.2 实验动物模型

1.2.1 早期妊娠 将性成熟的雌性大鼠与雄性大鼠按3:1的比例于16:00 合笼进行交配，次日07:00 进行检栓及阴道涂片，在雌鼠阴道内发现精子则记作该鼠妊娠怀孕的第1 天。收集早期妊娠1～9 d 的大鼠子宫，在对应天数09:00 之前完成取材。第1 天子宫取材是以雌鼠见栓和阴道涂片发现精子为依据；第2～5 天子宫取材需用生理盐水从输卵管或子宫中冲出胚胎确定妊娠；第6 天子宫取材前，先从大鼠尾部静脉注射1%芝加哥蓝，以确认大鼠胚胎的着床位点；第7～9 天，在大鼠子宫中已经能明显观察出着床位点，确定妊娠发生，可直接取材。

1.2.2 人工诱导蜕膜化 选取健康且输精管结扎、性成熟的雄性大鼠，与性成熟的健康雌性大鼠1 对1 进行交配，次日见到阴道栓证明交配成功，见栓当日记为假孕第1 天。在其假孕第5 天时，对其中一侧子宫的子宫角进行芝麻油注射，另一侧不注射，作为对照。在第9 天时处死、取材。

1.3 荧光定量PCR

1.3.1 引物设计合成 根据荧光定量设计要求，于NCBI中获取大鼠SerpinB6b基因、GAPDH基因和PRL基因的mRNA 序列并用Primer 5 进行引物设计。选取引物（表1）送通用生物系统（安徽）有限公司进行合成。

表1 引物序列

1.3.2 总RNA 提取及cDNA 合成 按照RNA 提取试剂盒（TRIzol®Reagent kit，Invitrogen 公司）说明 进行大鼠子宫组织总RNA 提取实验。Nano Drop 2000（Thermo 公司）测定RNA 浓度及纯度；使用反转录试剂盒（GoScript Reverse Transcription Mix，Promega公司），反转录合成cDNA，保存在-20℃。

1.3.3 荧光定量PCR 使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa 公司），反应体系为10 μL，按照说明书操作，反应条件：95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，40 个循环后收集荧光信号。在Amplied Biosystems®7500 Real-Time PCR System（Amplied Biosystems）机器中进行，反应过程以GAPDH为内参，计算基因相对表达量，采用2－△△ct进行数据分析。

1.4 原位杂交 将冻存的正常妊娠1～9 d 和人工蜕膜化大鼠子宫组织切片、4%多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）固定1 h。使用地高辛标记的SerpinB6bRNA 探针于杂交液中，55 ℃杂交过夜。洗涤，1% Blocking solution 室温封闭1 h。Anti-DNP-AP（1:200，PerkinElmer公司）4 ℃避光孵育过夜。滴加显色试剂NBT/BCIP（1:50）与 2 mmol/L 左旋咪唑室温显色，甲基绿对染，甘油封片，照相。

1.5 免疫组织化学 取石蜡包埋的正常妊娠1～9 d 和人工蜕膜化大鼠子宫组织切片、烘片1 h，用二甲苯除蜡；梯度乙醇入水；柠檬酸钠修复液98℃修复10 min；3%H2O2去除内源性过氧化物酶；10%马血清（用PBS 配制）室温避光孵育1 h；兔抗大鼠SerpinB6b 单克隆抗体（1:1 000）4℃避光孵育过夜；洗涤，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（ABclonal 公司）室温避光孵育1 h；DAB显色；苏木精对染，脱水、透明、中性树脂封片，照相。

1.6 蛋白质印迹分析 将冻存的正常妊娠1～9 d 和人工蜕膜化大鼠子宫组织加入到冰上预冷的蛋白裂解液中，用匀浆器间隔研磨，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Biosharp 公司）测定蛋白样品浓度。将等量蛋白煮沸变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）。将蛋白电转移转膜后用5%脱脂奶粉溶液（美国BD 公司）37℃封闭1 h，然后用兔源SerpinB6b 一抗（1:400）和鼠源 GAPDH 一抗（1:3 000，Santa Cruz 公司）4℃孵育过夜。PBST 液洗3 次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，再PBST 液洗3 次，每次5 min，用ECL 超敏发光液（南京诺唯赞公司）显影。

1.7 原代大鼠子宫内膜基质细胞的培养和诱导蜕膜化处理 将假孕第5 天的雌性大鼠颈椎脱臼处死，取子宫，然后用HBSS洗3遍，去除杂质和血细胞；胰酶（2%）消化，4℃40 min，每10 min 间隔摇晃；37℃水浴15 min；用10%活性碳吸附的胎牛血清以1:10 的比例终止胰酶消化；胶原酶（0.5%）消化基质细胞，37℃水浴15 min，然后用HBSS 终止消化反应，1 000 ×g 离心7 min（4℃），离心弃上清，重复3 次；加入新鲜含10% 活性碳吸附的胎牛血清的DMEM/F12 培养液混匀，按1×106个细胞/皿的量接种于35mm 培养皿，37℃、5%CO2恒温培养箱培养；当细胞贴壁生长密度达到80%，更换为含2%活性炭处理血清的DMEM/F12 培养液，并在培养液中添加36 nmol/L 的雌二醇、1 μmol/L 的醋酸甲氢孕酮和0.1 mmol/L 的二丁酰环腺苷酸，对大鼠子宫内膜基质细胞进行诱导培养；除实验组外，对照组为以仅含胎牛血清的正常培养液培养的细胞；每天进行相同的上述激素处理，分别收集第1、3、6、9 天的细胞。用小量总RNA 提取试剂盒（Magen 公司）提取细胞RNA。荧光定量PCR 检测PRL和SerpinB6bmRNA 的表达。以PRL表达量的变化值作为检验模型是否建立成功的标准。

1.8 统计分析 采用GraphPad Prism 5.0 软件绘图并分析数据。实验数据用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或 Student´s t 检验。用ImageJ 软件对灰度进行相对定量分析，以GAPDH作为内参。

2 结果

2.1SerpinB6b在大鼠早期妊娠子宫中的表达情况 荧光定量PCR、原位杂交、免疫组化和蛋白质免疫印记结果显示，SerpinB6bmRNA 和蛋白在大鼠早期妊娠1～5 d子宫腔上皮、腺上皮有微弱表达；在第6 天的胚胎和蜕膜细胞表达；在7～9 d，表达主要集中在胚胎和蜕膜区，且随蜕膜程度增加，表达量也逐渐增强，且在第8 天达到最高（图 1）。

2.2SerpinB6b在大鼠人工诱导蜕膜化模型子宫中的表达情况SerpinB6b在人工蜕膜区的mRNA 和蛋白表达均显著高于非蜕膜区。以PRL表达量的变化值作为检验模型是否建立成功的标准（图2）。

2.3SerpinB6bmRNA 在体外诱导蜕膜化大鼠子宫基质细胞中的表达 如图3 所示，随着诱导时间的增加，蜕膜化标志分子PRL 的表达逐渐升高，并显著高于对照组，表明诱导蜕膜化成功（图3-A）；随着诱导时间的增加，SerpinB6b的表达逐渐升高，并显著高于对照组（图3-B）。

3 讨 论

细胞凋亡参与早期妊娠的胚胎着床和蜕膜化过程。子宫对植入的囊胚作出反应，经过广泛的组织修饰形成蜕膜化，这种修饰包括上皮细胞和基质细胞的分化和凋亡[7]。胚胎着床时其周围的基质细胞停止增殖并经历分化，形成初级蜕膜区和次级蜕膜区，最终初级蜕膜区和次级蜕膜区经历细胞凋亡，扩大了植入室以适应生长中的胚胎[8]。Kokawa 等[9]报道，细胞凋亡的变化及异常表达与妊娠的发生、发展有着密切的关系。本实验结果发现，SerpinB6b主要定位于胚胎和蜕膜组织，而且SerpinB6b的表达随蜕膜化的进行而增强，这提示SerpinB6b参与子宫基质细胞的蜕膜化过程。鉴于大鼠子宫蜕膜中含蜕膜细胞、免疫细胞等多种细胞，为了明确SerpinB6b是否参与子宫基质细胞的蜕膜化过程，本研究体外培养大鼠子宫基质细胞并诱导蜕膜化，对其连续诱导9 d，蜕膜化标志分子PRL显著上升，表明细胞的确向蜕膜细胞分化。在这个过程中，SerpinB6b的表达明显升高，但SerpinB6b在大鼠早期妊娠过程如何发挥作用未知。近年来研究发现SerpinB 家族成员的功能与细胞凋亡相关。Cohen 综合征是一种由于中性粒细胞大量凋亡导致中性粒细胞减少所引起的罕见疾病。Duplomb 等[10]研究发现，SerpinB1在Cohen 综合征患者的中性粒细胞中表达显著降低，推测SerpinB1可能参与细胞凋亡过程。SerpinB2 能与成视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma Protein，Rb）结合，保护其免受钙蛋白酶的裂解，并提高Rb 蛋白水平、增强肿瘤细胞存活。Rb 在细胞增殖与凋亡方面扮演重要角色，猜想SerpinB2可能参与细胞凋亡发生[11]。同样，SerpinB3也被认为是参与细胞凋亡调节的多种细胞因子之一[12]。SerpinB6b是否参与细胞凋亡调控进而在早期妊娠发挥作用值得进一步研究。

胚胎滋养层侵入蜕膜时，细胞外基质同时进行降解反应，具有溶解作用的蛋白酶在胚胎着床过程中发挥重要作用[13-14]。蜕膜化启动的过程中，一些蛋白酶或被激活或被抑制，蛋白酶抑制剂与蛋白之间会达成一种平衡，来维持妊娠进行。丝氨酸、半胱氨酸和基质金属蛋白酶3 个蛋白酶家族参与胚胎着床中的基质细胞降解[15]。子宫内膜衍生的外泌体的金属蛋白酶在促进胚胎着床过程中也发挥重要作用[16]。有研究发现，SerpinB3b能抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性[17]，在小鼠胚胎发育进程中，胚胎胞质内胰蛋白酶样的活性增强[18]，推测SerpinB3b在胚胎发育过程发挥作用。本研究中SerpinB6b在蜕膜中高表达，可能与丝氨酸蛋白酶抑制剂参与子宫基质细胞的降解、形成蜕膜细胞的过程有关，其机制有待进一步研究。

4 结 论

本实验中，SerpinB6bmRNA 在大鼠早期妊娠1～5 d在腔上皮与腺上皮表达微弱，在6～9 d 蜕膜区强表达；在人工蜕膜化模型中人工蜕膜侧的表达高于对照侧；SerpinB6b 蛋白的表达与SerpinB6bmRNA 的表达类似；并且在体外培养的大鼠子宫内膜基质细胞中，随着诱导蜕膜化天数的增加SerpinB6b也呈上升趋势，证明SerpinB6b在大鼠胚胎着床和蜕膜化过程发挥重要作用。本实验结果表明，SerpinB6b很可能参与胚胎着床与蜕膜化过程的发生，进而在大鼠早期妊娠过程中发挥作用。