寨卡病毒检测技术的研究进展*

郑 茂 综述，刘 晓，袁成良 审校

(四川省德阳市人民医院检验科，四川德阳 618000)

寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA包膜病毒，直径为40～70 nm，核酸长度约10.7 kb，分别编码3种结构蛋白(C、prM/M、E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)[1]。寨卡病毒进入人体后，多以隐性感染为主，引起低热、皮疹、结膜炎及关节肌肉痛等非特异性临床症状，易与登革热病毒、基孔肯雅热病毒感染等相混淆，早期诊断十分困难。寨卡病毒能通过胎盘和血脑屏障，孕妇感染后可能导致胎儿严重先天性缺陷，其中以新生儿小头畸形最为常见。宫内感染寨卡病毒可能会使胎儿神经发育迟缓，膀胱及肾脏发育不全，成人感染寨卡病毒可能会引起吉兰-巴雷综合征(GBS)。因此，建立灵敏且特异的寨卡病毒早期检测技术，对快速诊断病毒感染尤为必要，本文简要阐述了寨卡病毒的流行病学特征，并重点对近年来寨卡病毒的检测技术进行综述。

1 寨卡病毒感染的流行病学特征

寨卡病毒感染的患者或其他灵长类动物均可作为病毒传染源，通过蚊媒传播、母婴传播、性传播等方式扩散[2]。寨卡病毒最早于1947年在东非乌干达寨卡森林的恒河猴体内分离成功，并因此而得名，不久后在非洲、太平洋岛国等地区陆续出现人感染寨卡病毒的报道；2007年，在西太平洋的雅浦群岛出现首次寨卡病毒大范围疫情；2015年3月，巴西发生史上最大规模的寨卡病毒暴发、流行，导致超过20万例患者感染，随后在南美洲迅速传播；2016年2月1日，WHO宣布寨卡病毒感染疫情已成为“国际关注的突发公共卫生事件”，并于2016年11月18日将其转为长期机制应对[2]。

2016年2月，我国发现首例输入性寨卡病毒感染病例，随后广东、浙江、江苏、北京、河南等省市陆续报道了输入性病例，其中广东省出入境人流量巨大，是我国最主要的流行地区[3]。如果不及时控制输入性寨卡病毒疫情，极可能造成暴发、流行。根据寨卡病毒基因组序列的不同，将其分为亚洲型和非洲型，两种亚型同源性在90%左右。亚洲型寨卡病毒可导致新生儿小头畸形、成人GBS等严重疾病，尚未见非洲型寨卡病毒导致上述疾病的报道，我国目前分离的所有寨卡病毒株均为亚洲型，总体变异率不高[4]。

2 寨卡病毒检测技术

2.1病毒分离培养 病毒分离培养是应用细胞组织培养技术从感染者血液、尿液、唾液、羊水、精液等各类标本中分离出病毒，被认为是实验室检测的“金标准”。寨卡病毒常用细胞培养、动物体内接种等方式进行分离。多种细胞系均适合于寨卡病毒的培养，如人胚肾细胞HEK293、非洲绿猴肾细胞Vero等。动物体内接种是最早应用的病毒培养方法，将病毒接种于易感动物的皮下、腹腔、颅内等部位，从而实现病毒的快速增殖，我国报道的首例寨卡病毒即采用乳鼠颅内接种得以成功分离[5]。然而，寨卡病毒属于第3类病原体，其分离培养必须在二级生物安全实验室进行，故普通实验室难以开展。

80%以上的寨卡病毒感染为隐性感染，送检的临床标本中病毒载量往往偏低，需要经过多次培养传代才可能分离到病毒。因此，病毒分离培养虽然特异度高，具有确诊意义，但灵敏度低、操作复杂、耗时长，难以实现大批量标本的快速检测，目前仅限于科研或其他鉴定方法的复核。

2.2血清学检测

2.2.1单克隆抗体检测 人体感染寨卡病毒3～5 d即可出现特异性IgM抗体，通过检测IgM抗体可对病毒感染进行早期诊断。IgG抗体在血清中出现较晚，存在时间长，若IgG抗体检测阳性则可判断为再次感染或慢性感染。NS1蛋白是寨卡病毒7种非结构蛋白中唯一能以可溶性六聚体形式分泌至感染者外周血，在感染早期即可出现且存在时间长的蛋白。BOSCH等[6]采用重组NS1蛋白免疫小鼠筛选出一系列特异性抗体，建立了针对NS1抗原的快速检测试纸，灵敏度和特异度可分别达81.0%、86.0%。KIM等[7]进一步研发出寨卡病毒首个单克隆抗体快速检测试剂盒，作用靶点是E蛋白和NS1蛋白的IgG或IgM抗体，IgG抗体的检测灵敏度和特异度分别为99.0%、99.3%，IgM抗体的检测灵敏度和特异度分别为96.7%、98.7%，且与登革热病毒IgG和IgM抗体的交叉反应率仅为16.7%、5.6%，可见该试剂盒使用简便，且灵敏度和特异度均较高。我国学者向梦蓉等[8]设计的NS1抗原免疫层析胶体金试纸可成功区分寨卡病毒和登革热病毒，同样具有较高的灵敏度和特异度。单克隆抗体检测技术日趋成熟，有望作为全球寨卡病毒流行地区的即时诊断和大规模筛查工具，但后期也仍需大量临床样本的持续验证试验。

2.2.2酶联免疫吸附试验(ELISA) 根据ELISA原理的不同可分为间接法、竞争法、双抗体夹心法等。ELISA检测病毒感染的优点是成本低、易操作、对设备要求低、可广泛应用于基层实验室，故成为目前寨卡病毒最常见的血清学检测方法。ELISA检测寨卡病毒的特异性靶位主要集中于NS1蛋白和E蛋白。研究显示，通过构建NS1基因的原核表达质粒，利用大肠杆菌表达重组NS1蛋白或构建NS1基因的真核表达载体，利用HEK293F细胞表达重组NS1蛋白纯化蛋白后免疫小鼠，均能制备出高纯度的抗NS1单克隆抗体[9-10]，这为建立ELISA检测方法提供了基础。

中国疾病预防控制中心的科研团队[11]选取寨卡病毒4种抗原(E蛋白胞外区、NS1蛋白、C蛋白、rE Ⅲ蛋白)进行重组表达和纯化，以间接法检测相应的IgG抗体，发现E蛋白胞外区和NS1蛋白的检测灵敏度和特异度均达到较高水平，适合作为寨卡病毒的靶抗原。此外，该团队还发现以NS1蛋白作为检测抗原，采用间接法检测感染者血清、尿液和唾液标本中的IgA抗体，可以作为IgG抗体的替代指标[12]。新加坡生物工程与纳米技术研究所的科研团队[13]以单链DNA作为结合靶位点，建立了针对寨卡病毒NS1蛋白的ELISA双抗体夹心法，具有极高的灵敏度，检出限可低至0.1 ng/mL。

E蛋白是寨卡病毒感染和复制的必需蛋白质，参与病毒与宿主受体细胞的识别，具有3种不同结构域，包括β桶状的Ⅰ区(E Ⅰ)、参与E蛋白二聚体形成的Ⅱ区(E Ⅱ)及具有免疫球蛋白样结构的Ⅲ区(E Ⅲ)，其中E Ⅰ/E Ⅱ可作为鉴定寨卡病毒的特异性B细胞表位[14]。柳红妙等[15]设计了一种检测寨卡病毒E蛋白的非包被ELISA，该方法与聚合酶链反应(PCR)检测结果基本一致，且与登革热病毒无交叉反应，在抗寨卡病毒药物筛选方面具有较强优势。

除了常见的NS1蛋白和E蛋白的检测外，国外学者利用多肽微阵列的筛检方法发现寨卡病毒NS2b蛋白中1段20个氨基酸的多肽序列(NS2b-20)，用于ELISA检测的灵敏度和特异度可达96.0%、95.9%[16]。以该段特异性抗原多肽序列作为靶抗原，我国学者王天禹等[17]建立了一种高通量、高灵敏度的荧光素酶联免疫吸附试验(LISA)，应用于寨卡病毒的IgG抗体检测，为实现高通量自动化检测提供了基础，适合寨卡病毒感染的免疫学诊断与流行病学调查。此外，近期PAWLEY等[18]从巴西寨卡病毒感染者中分离出一种特异性抗体，可以直接结合寨卡病毒免疫显性表位，从而设计出一种高效的ELISA检测方法，适合多种体液标本检测，如尿液、唾液、血清和全血，其中尿液标本无基质效应且采集方便，可作为优先检测标本。由此可见，多种寨卡病毒靶抗原可以应用ELISA检测，感染者的各类体液标本也适合作为检测对象，有效拓展了血清学方法在病毒检测中的应用。

2.2.3中和试验 中和试验是病毒与相应抗体结合后，失去对易感动物致病力的试验方法，主要检测待检标本中病毒特异性中和抗体的水平。蚀斑减少中和试验(PRNT)在检测寨卡病毒中和抗体方面的应用较为广泛。PRNT以使蚀斑数减少50%的血清稀释度作为效价，在确认病毒阳性标本上更具特异性。NASCIMENTO等[19]报道PRNT尤其适合于寨卡病毒感染者恢复期标本的特异性检测。因此，美国疾病控制和预防中心(CDC)建议寨卡病毒IgM抗体ELISA检测阳性的血清标本应通过PRNT进行确认。

与病毒分离培养的优缺点相似，虽然PRNT特异度高，但试验过程非常耗时、耗力。为了弥补PRNT这一不足，KOISHI等[20]研发了基于高通量图像荧光的寨卡病毒中和试验，该方法检测速度更快，并实现了多标本同时检测，可用于寨卡病毒感染的临床诊断确认及临床疫苗研究。

2.2.4其他血清学检测技术 LAURI等[21]报道了一种用于诊断寨卡病毒感染的新型血清学方法，利用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)，用两种发色基团分别标记NS1蛋白和细菌L蛋白，再与特定分子蛋白结合。这种基于荧光共振能量转移(FRET)的血清学方法适用于诊断寨卡病毒感染，并易与其他黄病毒感染进行鉴别。此外，还有研究报道可通过流式细胞术鉴定血清中的寨卡病毒中和抗体[22]。

2.3核酸检测

2.3.1反转录-PCR(RT-PCR) 寨卡病毒感染者血液、尿液、唾液、精液、羊水或胎盘组织等标本中均可检出病毒RNA[23]。不同类型标本检出时间各有不同，血清在病毒感染后7 d内可被检出，尿液为20 d内，精液可长达60 d。RT-PCR技术是从核酸水平检测病毒RNA，相对于病毒分离培养，鉴定周期缩短。在患者感染早期，特别是临床症状出现的1周内，若检测到寨卡病毒RNA即可快速确诊[24]。但常规RT-PCR首先需要对病毒RNA进行反转录，再进行目标基因扩增，最后通过凝胶电泳分析扩增产物，该方法操作较为烦琐，只能对扩增产物进行半定量分析，且易被污染，假阳性率偏高，目前已逐步被其他PCR技术代替。

2.3.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR) RT-qPCR采用插入特异性荧光探针，实现对病毒RNA的定量分析，具有操作简便，灵敏度、特异度高等特点，无需对扩增产物进行后续分析，故可有效避免人为操作带来的污染，与常规RT-PCR相比，极大提高了检测效率。在巴西东南部寨卡病毒流行区域，AYRES等[25]通过RT-qPCR在埃及伊蚊、白纹伊蚊和库蚊中检测出寨卡病毒RNA，直接证实了蚊媒传播是寨卡病毒感染的主要途径。

RT-qPCR根据采集荧光方法的不同主要分为染料法和探针法。染料法是利用某些荧光染料(如SYBR Green)与双链DNA结合后荧光强度明显增强，从而被荧光检测器检出。XU等[26]通过优化基于SYBR Green探针的PCR引物设计后，实现了RT-qPCR一步法检测寨卡病毒RNA，甚至可以检测低至1 PFU/mL滴度的寨卡病毒。探针法是能与目的片段特异性结合的荧光探针，用相应酶水解探针后释放荧光，从而实时定量扩增产物，最为常用的是TaqMan探针。JUDICE等[27]通过研发一种新型TaqMan探针，使RT-qPCR在检测寨卡病毒NS5基因方面达到更高的灵敏度，并且在血液和尿液标本中的检测结果高度一致。实验室内部核酸交叉污染可能导致检测结果呈假阳性，为了提高寨卡病毒核酸检测的准确性，也可对E基因、NS5基因等多个分子靶位同时进行检测，以涵盖寨卡病毒多个谱系。

赵航等[28]通过分析寨卡病毒全基因组核酸序列，以NS5基因片段设计特异性引物，构建重组质粒，建立了基于RT-qPCR的寨卡病毒核酸检测的高灵敏度方法，且该方法与登革热病毒、丙型肝炎病毒无交叉反应。此外，针对亚洲型和非洲型寨卡病毒，我国学者根据两种亚型病毒基因组序列特征，分别设计了相应的RT-qPCR检测技术，实现了对病毒载量的绝对定量，可有效用于感染者的病原分型、早期诊断[29]。

针对RT-qPCR在极低寨卡病毒载量检测方面的不足，南方医科大学研究团队[30]研发了一种微滴式数字PCR，在极低病毒载量的临床标本中也表现出较高的灵敏度和特异度。此外，广东医科大学研究团队[31]对PCR操作过程进行简化，自主研发了直接反转录定量PCR(dirRT-qPCR)，无需对标本进行预处理，可直接检测临床标本中的寨卡病毒RNA，检测限可低至95个RNA，且标本量仅需5 μL。此外，dirRT-qPCR具有高通量和即时诊断的能力，还可以扩展用于其他病毒检测，显现出床旁检测及快速现场筛查的巨大潜力。

2.3.3其他基因扩增技术 近年来，在传统RT-PCR基础上，科学家们研发出了一系列高效、灵敏的基因扩增技术，如链侵入式扩增技术、环介导恒温扩增(LAMP)技术等，其中又以LAMP技术应用较为广泛。LAMP技术是在单一恒定温度下(通常为65 ℃)，使用4～6个引物，通过链置换DNA聚合酶快速扩增获得新DNA，在1 h内即可完成检测[32]，且该方法仅需一台普通加热仪，可用于快速检测及在一些资源匮乏地区对病毒的实时监测。钟响等[33]针对寨卡病毒NS5基因设计并筛选的LAMP引物可在64 ℃ 50 min内特异性扩增NS5基因，并且与基孔肯雅热病毒、登革热病毒、黄热病毒均无交叉反应，检测限达10 copy/μL，是普通PCR的100倍，可见改进后的LAMP技术的灵敏度得到大幅提升。近期，ESTRELA等[34]在Bst DNA聚合酶基础上，进一步优化LAMP技术检测条件，将寨卡病毒检测时间缩短至10 min。对于寨卡病毒感染的急性期，CASTRO等[35]报道还可通过LAMP技术检测感染者唾液标本，从而实现快速诊断。

2.4生物传感器检测 生物传感器是一种将生物元件与被测物质相互作用所产生的物理化学效应转变为电信号进行检测的仪器。随着计算机软件模拟技术的迅速发展，生物传感器技术已扩展到了病毒早期诊断的领域。MOCO等[36]使用石墨电极平台研发了一种电化学生物传感器，检测寨卡病毒RNA仅需20 min，检测限达1.72 copy/mL，且该传感器在60 d内均具有良好的稳定性。也有学者使用表面印迹聚合物和氧化石墨烯复合材料，研发出新型寨卡病毒电化学生物传感器，检测限甚至可达到RT-qPCR的水平[37]。有文献报道了一种基于芯片的电位传感器，采用3D分子印迹技术可快速检测缓冲液中低至10 PFU/mL滴度的寨卡病毒[38]。

此外，针对寨卡病毒NS1蛋白，TAKEMURA等[39]研发出一种等离子体共振放大免疫荧光生物传感器，可实现快速检测。类似研究中，ZHANG等[40]还报道了一种基于生物检测信号的新型乳液凝集试验，该试验简便、廉价，适合于寨卡病毒NS1蛋白的现场检测。

3 结 语

寨卡病毒是黄病毒属中第一个被报道能通过母婴传播、性传播的病毒。目前国内外尚无抗寨卡病毒感染的靶向药物，病毒疫苗也仍处于临床试验阶段。因此，建立经济、快速、特异度高的寨卡病毒检测方法，对病毒感染的早期诊断尤为重要。病毒分离培养虽然是实验室检测的“金标准”，但培养要求高，应用极为局限，常规条件下难以开展，故普通实验室多通过血清学或核酸检测寨卡病毒感染。血清学方法操作简便、成本低廉、易于推广，但仍存在一定程度的假阴性及与其他黄病毒属的交叉反应，故常将其与PCR技术联合应用，从而提高寨卡病毒的诊断效能。新兴的生物传感器技术，虽然初期检测寨卡病毒灵敏度方面与PCR技术相比尚有一定差距，但随着该技术的日益发展，目前其检测限已达到实验室的常规要求，且其快速和高通量检测潜力是常规方法无法比拟的，应用空间极为广阔，有望取代现有的主流检测技术。随着病毒检测技术及病毒基因组学的蓬勃发展，寨卡病毒在不远的将来也能实现可预防、可控制、易治疗。