两种转基因斑马鱼在实际监测中的应用

张小琼，陈 桥，徐东炯，张 翔，沈丽娟，张海燕，沈 伟，吴 旦，周国栋，刘春生

(1.江苏省常州环境监测中心，江苏常州213001；2.江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室，江苏常州213001；3.华中农业大学，湖北武汉430070)

在使用鱼类作为监测生物的众多研究中，常使用模式生物斑马鱼进行实验研究。斑马鱼（Daniorerio）又称“zebrafish”，属于硬骨鱼类，原产印度、孟加拉国，是一种杂食性的热带淡水鱼。

近年来，国内外运用转基因斑马鱼检测水体环境中的重金属毒性[1-2]、环境激素[3]、综合毒性[4]和有机污染物毒性[5]等，成效显著，日益受到关注。这种方法通常是使用受到不同环境污染物如重金属或环境雌激素、芳香烃等污染影响的启动调控元件，利用该元件诱导荧光或荧光酶的表达。使用转基因斑马鱼监控环境污染物的另一种方法是使用整合了大量大肠杆菌穿梭载体的转基因斑马鱼检测环境诱变剂，分析环境污染物对生物体的诱变范围[6]。

在高温、重金属等压力胁迫条件下，生物体细胞中的热激蛋白HSP会在保护和修复途径中发挥重要作用。Seok等利用斑马鱼转基因技术研究硫酸铜对人类HSP70启动子的特异性激活[7]，表明斑马鱼可以作为转基因生物传感器检测环境中的异生毒性物质。纪喜文等[8]构建了一种GFP转基因斑马鱼报告系统，利用芳香烃反应元件AHRDtk控制报告基因绿色荧光蛋白在斑马鱼体内的表达,通过显微镜观察转基因斑马鱼体内的绿色荧光表达情况,可以直观判断水环境中是否含有该类化学物质。上海复旦大学经过多年研究，成功构建了卵黄蛋白原1（vtg1）启动子调控绿色荧光蛋白表达的转基因斑马鱼品系，可以简便直观快速地监测环境中的雌激素类物质，如β-雌二醇（E2）、氯化镉、玉米烯酮、雌三醇（E3）等[9]。

本研究运用两种转基因斑马鱼对地表水和污染源来水进行监测，探讨实际应用的可行性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：莱卡体式显微镜（LeicaM205FA）。

分析处理软件：ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）；

数据处理与统计分析软件：SPSS19.0。

试剂：储备液用高纯度的二甲基亚枫（DMSO）配制，配制好后放置于4℃冰箱备用；麻醉剂MS-222，美国Fluka公司；甲基纤维素，国药集团化学试剂有限公司；斑马鱼胚胎培养液用海盐，配制。本实验中其他化学试剂均为分析纯。

斑马鱼：Kras、Cypla型转基因斑马鱼。Kras转基因斑马鱼为致肝癌类敏感的转基因报告鱼；Cyp1a转基因斑马鱼为类二噁英类敏感的转基因报告鱼。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎暴露

将斑马鱼杂交繁殖所得到的胚胎置于不同浓度的化学品中暴露。对照组和暴露组的DMSO终浓度为0.01%（V/V），每个浓度实验组和对照组均设置3个平行。暴露容器为12孔板，每个孔放置10mL胚胎培养液和20个胚胎。暴露后，放置于28℃恒温培养箱中进行培养。光照与黑暗周期比为14h∶10h。实验期间，对12孔板中的胚胎培养液以及暴露液每24h进行更换，以保持暴露浓度的恒定。实验期间实时观察斑马鱼胚胎的情况，一旦发现死亡的个体（白点），及时挑出。

1.2.2 照片采集

在斑马鱼胚胎暴露至96h时，对所暴露的斑马鱼幼鱼进行拍照取样。使用70mg/L的MS-222对暴露后的斑马鱼幼鱼进行麻醉。随后从每个孔中随机挑选5～8条幼鱼在荧光显微镜下观察其荧光，并将其放置于3%的甲基纤维素中，用牙签摆正姿势，进而在莱卡显微镜下进行拍照。拍照时放大倍率30倍，每条幼鱼位置摆正后在显微镜下进行拍照，照片附上比例尺。

1.2.3 照片分析

对拍照取样后斑马鱼胚胎的照片使用ImageJ软件进行分析，统计斑马鱼幼鱼肝脏荧光部分的强度以及面积。

2 结果与分析

选用来自不同行业的尾水和处理后的排放水作为典型污染源水样：中天钢铁为金属冶炼类（中天前）和吉恩化工的处理前后水样（吉恩前、吉恩后）。饮用水源地选择长江水源地魏村水厂（魏村）和地表水（横洛间）。利用两种不同类型的转基因斑马鱼（Kras、Cypla）进行测试。其中吉恩前水样因用斑马鱼胚胎检测，其具有急性毒性，因此未做后续的荧光蛋白检测。

2.1 广谱型Kras测试结果（图1）

图1 广谱型Kras荧光蛋白毒性反应

四个处理组的肝脏荧光面积和荧光强度均显著性降低，造成比空白对照更低的原因可能是废水中存在的某些化学物质能够抑制Kras基因的表达，也可能是通过与诱导剂的结合抑制反应，从而使诱导剂失效。

2.2 特异型Cypla测试结果（图2）

图2 特异型Cypla荧光蛋白毒性反应

所有实际样品的肝脏荧光面积和荧光强度与对照组相比无显著差异，说明这些废水中不存在致癌类化学物质。

在本研究中发现对于某些化学物质，转基因斑马鱼的荧光指标在敏感性上与畸形率、心率等指标相比并不具有优势。对金属类物质的检测，荧光强度和面积指标不敏感。对于综合性的污水、地表水，转基因斑马鱼显示的毒性结果还需要通过其他方式进一步确定污染物质类型。转基因斑马鱼的荧光强度和面积在不同的水样中表现出比空白高或低的结果，结果的表征不太统一。

斑马鱼技术目前应用于环境监测业务还需要技术方法上继续开发和完善,累积更多的不同类型污染物的实验结果，调整实验方法，以求规范化、标准化；另外，在斑马鱼饲养、繁殖和实验方法上寻求突破，降低人为因素对实验结果的影响，开发自动化、智能化的技术和方法，造就高通量生物检测能力。