畜禽养殖场污水处理系统中诺氟沙星抗性菌的筛选及其抗性基因分析

赵翰斌,陈 鑫,武广哲,周纯淳,刘莉莉

(华东理工大学资源与环境工程学院/ 国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室,上海 200237)

抗生素在预防和治疗疾病中起着重要作用,同时也是农业和畜牧业的保障[1]。我国每年生产大约21万 t抗生素,其中46%的抗生素被用于畜牧业[2]。然而大多数抗生素并不能被动物肠道完全吸收,多达30%～90%的抗生素以母体化合物的形式通过粪便或尿液排出体外[3],进入污水处理系统中,诱导产生大量的抗性菌及抗性基因。EVERAGE等[4]从路易斯安那州蒂博多市污水处理厂中发现Escherichiacoli、Staphylococcusaureus、Enterococcusfaecalis、Enterobactercloacae这4种菌对其研究的大多数抗生素如四环素、氯霉素等均有抗性。YUAN等[5]从武汉一家典型的畜禽废水处理厂进出水中检测到了sulI、tetA、qnrD、mphB、mcr-1基因。CHEN等[6]从江苏12家不同畜禽养殖场的废水中检测到了tetA、tetC、sul1、sul2、oqxB、qnrS等基因。污水处理系统已经成为抗生素抗性菌和抗性基因的重要储存库[7]。

诺氟沙星是动物疾病治疗中应用最为广泛的氟喹诺酮类抗生素之一[8-10]。2013年我国诺氟沙星用量达5 400 t,其中兽用量占比为81.38%[11]。赵晶等[12]对上海市崇明岛养殖场粪肥中氟喹诺酮类抗生素进行调查,发现其总含量范围为9.00～950 μg·kg-1,平均值为144 μg·kg-1。ZHAO等[13]对我国8省畜禽养殖场的抗生素污染情况调查发现w(诺氟沙星)在养鸡场粪便中最高,达225.45 mg·kg-1,远高于w(土霉素)(10.56 mg·kg-1)和w(磺胺甲恶唑)(2.80 mg·kg-1)。同时,氟喹诺酮类抗性菌在污水处理系统中被频繁检出,例如JUNG等[14]从美国阿肯色州小石城污水处理厂的好氧池中分离得到Escherichiacoli菌株LR09,发现其含有环丙沙星-乙酰化变异基因aac(6′)-Ib-cr,并可通过乙酰化来降解环丙沙星和诺氟沙星。ZHANG等[15]从我国中部地区8家养鸡场和11家活禽市场的畜禽废水中分离得到206株弯曲杆菌菌株,发现所有菌株对诺氟沙星、环丙沙星和头孢唑啉具有抗性,并且还观察到对氟喹诺酮类,β-内酰胺类和四环素类抗生素的普遍抗性。此前的研究表明,微生物对氟喹诺酮类抗生素的耐药机制主要分为外排泵、酶的作用以及改变氟喹诺酮类抗生素结合位点[16-17]。JIA等[18]在研究降解菌对环丙沙星的降解作用过程中发现细胞色素P450酶〔京都基因与基因组百科全书(KEGG)蛋白编号:K00980〕能够将细胞体内环丙沙星的哌嗪基分解或羟基化成其他中间体。ZHANEL等[19]发现经过氟喹诺酮类抗生素治疗后分离得到的抗性铜绿假单胞菌中至少含有一种外排泵机制。目前,关于污水处理系统中诺氟沙星抗性菌的研究多集中在抗生素抗性及抗性基因的表达上。因此,开展畜禽养殖废水生物处理系统中诺氟沙星抗性基因的种类和遗传特性的研究对抗生素抗性菌的环境行为和风险评估具有重要意义。

该研究从畜禽养殖场污水处理系统中筛选分离得到诺氟沙星抗性菌,考查了该抗性菌中典型的抗性功能基因种类及遗传特性,可为评估畜禽养殖废水生物处理系统中抗生素抗性菌的环境行为和生态风险等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集及预处理

研究样品采集自江苏某肉鹅养殖场污水处理系统中的二沉池污泥,该处理工艺为上流式厌氧污泥床反应器(UASB)厌氧发酵串联厌氧-缺氧-好氧生物脱氮除磷工艺(A2/O)。取样设备经消毒处理,样品采集后于4 ℃条件下避光保存,用于后续抗性菌株的筛选和培养。

1.2 诺氟沙星储备液和培养基的配制

诺氟沙星储备液:称取100.0 mg诺氟沙星,加入超纯水溶解,转移到100 mL棕色容量瓶中定容。配制成ρ为1 000 mg·L-1的储备液,4 ℃条件下避光保存。

LB液体培养基:蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,氯化钠10.0 g,加去离子水定容到1 000 mL,用w为1%的HCl和1%的NaOH调节pH值为7。在高压灭菌锅中120 ℃灭菌20 min后4 ℃条件下保存[20]。

固体选择培养基:在1 000 mL液体培养基中加入3.0～4.0 g琼脂,在高压灭菌锅中120 ℃灭菌20 min,待温度降低至40～50 ℃时加入诺氟沙星储备液,倒入培养皿中,4 ℃条件下保存。

1.3 抗性菌的筛选和鉴定

取污泥样品5.0 g和液体培养基100 mL加入到250 mL锥形瓶中,加诺氟沙星储备液使其ρ分别为1、50、100、500 μg·L-1。将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中(30 ℃,150 r·min-1)培养15 d。重复转接3次后用灭菌后的生理盐水梯度稀释培养液,均匀涂布于固体选择培养基上,在恒温生化培养箱中30 ℃培养48 h后取单菌落分离纯化,得到诺氟沙星抗性菌。对所得菌株进行16S rRNA基因序列测定,在美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中进行核苷酸序列比对(Blastn),利用MEGA 5.1软件构建诺氟沙星抗性菌株的系统发育树[21]。

1.4 菌株抗性蛋白特性分析

根据抗性菌株的16S rRNA基因鉴定结果,选择与之同种的全基因组序列在京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)中进行蛋白功能注释,根据注释结果将抗性菌株的抗性蛋白与美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中已知的蛋白序列进行蛋白质序列比对(Blastp),选取相似度较高的蛋白序列,利用MEGA 5.1软件构建系统发育树,对抗性菌株的抗性蛋白进行同源性分析。

1.5 菌株抗性基因基因簇分析

根据抗性菌株抗性蛋白同源性分析结果,对其编码基因进行基因簇同线性分析,在抗性菌株的蛋白注释结果中选取该蛋白在内的前后各5条蛋白序列,将其与同线性分类数据库(SyntTax)中已知蛋白序列的同种属菌株进行比对,选择与菌株抗性蛋白编码顺序一致性较高的基因簇图,进行抗性基因的基因簇同线性分析。

2 结果与讨论

2.1 诺氟沙星抗性菌株鉴定

2.1.1菌株的生理生化特性

采用选择性培养基富集、筛选得到多株耐受诺氟沙星的抗性菌,取其中一株进行研究,将其取名为TY-1。该菌落呈乳黄色、圆形、湿润、有光泽、边缘光滑齐整〔图1(a)〕;革兰氏染色后菌体呈阴性、短杆状〔图1(b)〕。其生理生化特性鉴定结果见表1。

2.1.2抗性菌的16S rRNA基因鉴定

将菌株TY-1的16S rRNA基因序列提交到美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中,与所有已知菌的16S rRNA基因序列进行核苷酸序列比对(Blastn),发现菌株TY-1与鞘氨醇单胞菌属有较高同源性,选取与菌株TY-1相似度较高的菌株序列构建16S rRNA基因系统发育树(图2)。结果表明,菌株TY-1与Sphingomonassp. (KX641517)和Sphingomonassp. (KY357347)的同源性最高,相似度达98%,据此基本可认定菌株TY-1属鞘氨醇单胞菌属,且该菌属部分种属于条件致病菌[22],因此,有必要进一步对其抗性基因种类及其遗传特性等进行分析。

图1 菌株TY-1菌落形态和菌体形状观察

表1 菌株TY-1生理生化特性

图2 菌株TY-1的16S rRNA基因系统发育树

2.2 菌株TY-1对诺氟沙星的抗性分析

2.2.1菌株TY-1抗性蛋白特性分析

一般认为,同源性较高的蛋白质其功能相似甚至相同。因此,一条已知序列但功能未知的蛋白序列可以参考其同源蛋白的功能来推测[23]。在美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中进行核苷酸序列比对(Blastn)发现,菌株TY-1的16S rRNA基因序列与已知全基因序列的菌株Sphingomonassp. (JX219397)具有最高的同源性,相似度为99%,因此推测其在功能上也具有相似性。通过对Sphingomonassp.全基因序列的蛋白功能注释,可以近似分析菌株TY-1的蛋白序列信息(图3)。

图3 菌株TY-1 抗性蛋白序列系统发育树

注释结果发现菌株TY-1可能具有多种氟喹诺酮类抗生素抗性蛋白,如腺苷三磷酸结合盒转运蛋白〔the adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette transporter,ABC transporter〕(YP007614746)、主要易化子超家族转运蛋白(the major facilitator superfamily transporter,MFS transporter)(YP007617242)和细胞色素P450脱氢酶(YP007616462)等。有研究报道氟喹诺酮类抗性菌通过基因编码的腺苷三磷酸结合盒转运蛋白和主要易化子超家族转运蛋白具有氟喹诺酮类抗生素抗性[24-25]。抗性菌编码的细胞色素P450脱氢酶可通过改变诺氟沙星的结构影响诺氟沙星的活性,是抗性菌重要的抗性机制[19]。

将注释结果中发现的3种抗性蛋白序列与美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中已知微生物蛋白序列进行蛋白质序列比对(Blastp),发现菌株TY-1与鞘氨醇单胞菌属菌株的同源性较高,相似度均在99%以上,选取较高的序列构建系统发育树(图3)。3种抗性蛋白序列的比对结果均与Sphingomonasfennica所含蛋白序列的同源性高,且同时与其他多个鞘氨醇单胞菌属菌株如Sphingomonaslaterariae、Sphingomonaswittichii等具有较高的同源性,表明这些抗性蛋白的编码基因序列在Sphingomonas菌属中普遍存在。据此推测腺苷三磷酸结合盒转运蛋白、主要易化子超家族转运蛋白和细胞色素P450脱氢酶的编码基因在鞘氨醇单胞菌属中具有一定的遗传保守性。

2.2.2抗性蛋白编码基因基因簇分析

已有研究表明,多个连续蛋白编码基因在同一菌属内广泛存在,说明其更多来源于直系遗传,而该编码基因在相应的菌属中具有一定的保守性[22,26]。将菌株TY-1的抗性蛋白序列与同线性分类数据库(SyntTax)中同种属菌株的蛋白序列进行比对,以分析抗性蛋白编码基因的基因簇同线性及抗性基因的保守性。结果表明,菌株TY-1的腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的编码基因与鞘氨醇单胞菌属菌株Sphingomonassp. MM 1、Sphingomonassp. KC8、SphingomonaskoreensisABOJV和SphingomonashengshuiensisWHSC8的基因簇同线性较好,同时在这些菌株的基因序列中均包含腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ABC transporter)的编码基因〔图4(a)〕。

图4 菌株TY-1抗性蛋白编码基因在不同鞘氨醇单胞菌属间的对比分析

菌株TY-1的主要易化子超家族转运蛋白(MFS transporter)的编码基因与鞘氨醇单胞菌属菌株SphingomonasmelonisTY、SphingomonasmelonisZJ26、Sphingomonassp. NICI和SphingomonastaxiATCC55669的基因簇同线性较好,同时在这些菌株的基因序列中均包含主要易化子超家族转运蛋白的编码基因〔图4(b)〕。这些与腺苷三磷酸结合盒转运蛋白和主要易化子超家族转运蛋白的药物外排作用相吻合,据此推测菌株TY-1与其他鞘氨醇单胞菌一样,可通过外排泵作用将诺氟沙星泵出体外,使菌株获得诺氟沙星抗性。同时,菌株TY-1的细胞色素P450脱氢酶的编码基因与鞘氨醇单胞菌属菌株Sphingomonassp. MM 1和Sphingomonassp. KC8的基因簇具有较好的同线性〔图4(c)〕,且在这些菌株的基因序列中均包含细胞色素P450脱氢酶的编码基因,这与细胞色素P450脱氢酶的抗生素抗性相吻合,由此可推测该细胞色素P450脱氢酶的编码基因在鞘氨醇单胞菌属中具有普遍存在性,其对诺氟沙星抗性起积极作用。

3 结论

(1)从江苏省某肉鹅养殖场污水处理系统的二沉池污泥中筛选分离得到一株诺氟沙星抗性菌TY-1,经形态观察及16S rRNA基因序列分析,鉴定该菌株属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)。

(2)根据鞘氨醇单胞菌属菌株的全基因组蛋白功能注释结果可知,菌株TY-1对诺氟沙星的主要抗性机制为通过腺苷三磷酸结合盒转运蛋白和主要易化子超家族转运蛋白将诺氟沙星泵出体外,或利用细胞色素P450脱氢酶将诺氟沙星的哌嗪基分解或羟基化成其他中间体，导致诺氟沙星失活,且该菌株的诺氟沙星抗性蛋白与鞘氨醇单胞菌属的对应功能酶具有很高的同源性,功能上具有高度相似性。

(3)通过同线性分类数据库(SyntTax)对菌株TY-1中的抗性蛋白编码基因进行基因簇同线性分析,发现其抗性基因与鞘氨醇单胞菌属的其他已知菌株的基因簇同线性较好,表明腺苷三磷酸结合盒转运蛋白、主要易化子超家族转运蛋白和细胞色素P450脱氢酶这些功能酶在鞘氨醇单胞菌属菌株中具有普遍存在性,即具有一定的保守性。