MEG8、TGM2在胃癌组织中的表达及临床意义

安健健, 管鑫, 姜相君, 青岛大学附属青岛市市立医院消化内二科 山东省青岛市 266000

李思源, 青岛大学附属青岛市市立医院普外一科 山东省青岛市266000

徐晓娜, 青岛大学附属青岛市市立医院中心实验室 山东省青岛市266000

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一种死亡率高的常见恶性肿瘤, 根据最新全球癌症统计报告分析, GC位居全球常见肿瘤第五位, 成为癌症死亡的第三大原因[1]. 在我国,GC发病率和死亡率分别排名第二位和第三位[2]. GC的发病机制十分复杂, 其发生发展过程是多因素共同作用、长期积累的结果, 基因组学[3]、表观基因组[4]、代谢组学[5]等多方面仍在不断探索. 目前尚未发现有效的GC普查方法, 内镜筛查也尚未普及, 即使在GC发病率高的日本、韩国等发达国家[6], 且早期GC无特殊临床症状, 多数GC患者确诊时为进展期, GC的5年生存率仅为30%-35%[7], 迫切需要探索新的分子标志物协助GC诊断及预后判断, 非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)、蛋白质编码RNA是重要的功能调节分子, 介导多种细胞过程的, 参与多种疾病发生发展过程, 尤其是癌症基因调控过程[8,9]. 长链ncRNA母源性表达基因3(long ncRNA MEG3, lncRNA MEG3)在GC组织中表达下调, 抑制GC细胞增殖、迁移和侵袭, 在GC发生中起重要的调控作用[10]. 与MEG3共享DLK1-DIO3位点的母源性表达基因8(maternally expressed gene 8, MEG8)在GC方面尚未有研究报道. 转谷氨酰胺酶家族, 以其催化转酰胺或交联反应的能力为依据[11], 被广泛研究并发现其在多种疾病中发挥作用. 转谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2, TGM2)可以促进或抑制细胞死亡, 参与多种生理及病理过程,可诱导具有肽交联活性的肿瘤抑制因子降解, 参与肿瘤侵袭转移过程[12,13]. TGM2与GC患者预后间的关系需进一步证实. 本研究旨在通过检测 MEG8、TGM2在GC组织中的表达, 分析其在组织中的表达与患者临床病理特征之间的关系.

1 材料和方法

1.1 材料 收集自2018-01/2019-01于我院普外科收治的30例GC患者的手术切除的GC组织及癌旁组织标本, 癌旁组织取距离癌变边缘≥5 cm处. 患者术前均未行放化疗, 病历资料完整, 男性19例, 女性11例; 年龄44-85岁, 平均年龄66.9岁, Ⅰ期4例, Ⅱ期14例, Ⅲ期9例, Ⅳ期4例; 淋巴结转移者18例, 无淋巴结转移者12例; 远处转移4例, 无远处转移26例. 从Oncomine数据库中摘录来自Chen的GC研究数据(http://smd.stanford.edu/cgibin/publication/viewPublication.pl?pub_no=232), 展示了mRNA TGM2在29例胃正常黏膜、65例GC组织中的表达情况, 并根据所包含的85例GC患者随访数据, 分析TGM2表达与患者生存时间的关系. 本研究经本院伦理委员会批准(表1).

1.2 方法 组织样本RNA提取和荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测: 采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒提取GC组织标本中总RNA. 参照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent KIt with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书, 将提取的RNA进行逆转录反应, 在20 μL反转录反应体系中加入不超过1 μg总RNA进行cDNA 的合成. qRT-PCR使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)取2 μL cDNA 作为模板, lncRNA MEG8引物序列: 5’-TCCATGGCCACCAGCCTTA-3’; 5’-GG AACACAACAATCTTGATCCCAAC-3’, mRNA TGM2引物序列: 5’-CCCAGCAGGGCTTTATCTACCA-3’;5’-GCAGATGTCTAGGATCCCATCTTCA-3’引物浓度0.5 μmol/L, 20 μL体系进行扩增, 根据目标基因设计合成相应上、下游引物进行PCR扩增, 以GAPDH作为内参照. PCR反应在定量PCR反应仪上进行. 实验所得的数据运用公式RQ = 2-ΔΔCt的方法进行分析. 根据2-ΔΔCt值的中位数定义低表达和高表达, 即表达量＜2-ΔΔCt中位数, 为低表达, 反之为高表达.

统计学处理采用SPSS 19.0版软件进行统计学处理. 根据资料的类型不同, 采用不同的统计学方法分析,连续变量采用t检验, 分类变量采用χ2检验, 有序变量采用回归分析. 采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线, 并行Log-rank检验分析结果.P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 MEG8、TGM2在GC组织及癌旁组织中的表达情况 MEG8在30例GC组织中的相对表达量为0.462±0.082, 明显低于癌旁组织的1.048±0.149,P＜0.05, 具有统计学差异; TGM2在GC组织中的相对表达量明显高于癌旁组织(1.202±0.143vs0.742±0.083),P＜0.05, 差异具有统计学意义(图1、2).

2.2 MEG8、TGM2表达与GC患者临床病理特征的关系 MEG8表达与性别、肿瘤部位、分化程度、肿瘤大小、淋巴转移及远处转移无关,P＞0.05, 差异无统计学意义; 而与年龄、临床分期有关,P＜0.05, 差异具有统计学意义. TGM2表达在年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、肿瘤大小、淋巴转移及远处转移方面均未见明显差异(P＞0.05), 与临床分期有关, 差异具有统计学意义(P＜0.05)(表1).

2.3 TGM2在GC及正常胃黏膜中的表达情况及与患者预后关系 数据摘自Oncomine数据库, TGM2在GC及正常胃黏膜中的表达情况如图3, TGM2在GC组织中的表达明显高于正常胃黏膜组织, 有统计学差异(P＜0.05),根据85例GC患者随访数据绘制生存曲线如图4, TGM2表达情况与GC患者预后未见明显差异, 无统计学意义(P＞0.05).

3 讨论

肿瘤是威胁人类健康的重要原因, 权威期刊报道, 2018年癌症新增病例1810万例, 死亡病例达960万, 其中GC新增病例超过100万例, 估计有78.3万例死亡[1], 杨之洵等对我国GC发病趋势分析, 预计2020年中国GC发病率为24.30/10万, 新发病例数约为34.6万, 其中男性远多于女性, 我国各年龄组的GC发病率已呈现出下降趋势, 全人群的发病率增长趋势也有所缓解, 但仍高于世界平均水平[14]. 手术、放疗、化疗是恶性肿瘤传统的治疗方法, 但各有利弊[15], 为延长肿瘤患者的生存时间, 改善生活质量, 促使研究人员发展癌症治疗的新技术、新方法, 例如: 免疫疗法, 研究证实癌症免疫疗法已经取得了显著的临床疗效[16]. 由于GC早期临床症状不明显, 部分患者被确诊为晚期, 且局部肿瘤易侵袭、转移和复发,中国GC 5年生存率仅为35.9%[17]. 因此, 对GC发生发展的分子机制研究是十分有必要的, 有助于GC的早期诊断及治疗.

在人类基因组中占多数的转录本不编码蛋白质,即ncRNA, 被认为是解决疾病中基因失调的关键[18,19].长度＞200 nt的ncRNA被称为lncRNA[20], 参与多种生物学过程, 如: 组蛋白修饰, DNA甲基化和细胞转录等[21].lncRNA、mRNA在GC的发生发展过程中发挥其功能多样性, 例如: lncRNA GASL1通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制GC细胞的增长[22]; lncRNA FLVCR1-AS1通过竞争性结合miR-155促进c-myc表达, 通过FLVCR1-AS1-miR-155-c-Myc信号通路在GC中发挥癌基因的作用[23]. 抑制性κB激酶(inhibitory κB kinases, IKKS)和抑制性NF-κB激酶亚基ε的抑制因子(suppressor of IKKε,SIKE)的mRNA表达与GC的预后有着独特的关系, 可作为GC预后的有价值的生物标志物和潜在的治疗靶点[24].lncRNA、mRNA均可均可从血液、组织等临床样本中检测, 可作为早期诊断标志物; 表达差异可能与肿瘤分期、肿瘤类型等方面相关, 可用于判断预后; 可作为治疗靶点, 以对抗癌症进展[25], 为肿瘤的诊断、治疗、预后提供了新思路、新方向.

表1 母源性表达基因8与转谷氨酰胺酶2在30例胃癌患者癌及癌旁组织的表达与临床病理特征的关系(n = 15)

图1 母源性表达基因8在胃癌及癌旁组织中的表达情况. MEG8:母源性表达基因8.

图2 转谷氨酰胺酶2在胃癌及癌旁组织中的表达情况. TGM2: 转谷氨酰胺酶2.

图3 转谷氨酰胺酶2在胃癌及正常胃黏膜中的表达情况(数据摘自Oncomine数据库). TGM2: 转谷氨酰胺酶2.

图4 生存曲线，（n = 85）.

MEG8与MEG3共享DLK1-DIO3位点, 位于染色体14q32.3上. DLK1-DIO3印记区包括长链非编码RNA(MEG3、MEG8、MEG9和Linc00524)、miRNA、蛋白质编码基因等[26]. DLK1-DIO3簇某些组分的改变与疾病病理过程有关[27], 相关研究已证实, DLK1-DIO3簇某些蛋白编码基因参与肺癌及肝癌的发生过程; miRNA参与了不同肿瘤的发展, 如淋巴瘤、胶质母细胞瘤、胃肿瘤等[28]. MEG3被认为是一个非常重要的抑癌基因, 在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[29], 在肺癌、肝癌、GC、宫颈癌、结肠癌中表达下降, 与肿瘤的发生、发展、转移和化疗耐药有关[29]. 最近研究显示, 在肺癌及胰腺癌细胞株中, lncRNA MEG8参与转化生长因子-β介导的上皮间质转化(epithelial-mesenchy maltransition,EMT)过程, 对表观遗传EMT的诱导有显著的促进作用[30];LncRNA MEG8通过竞争性结合miR-181a-5p促进PPARα蛋白表达, 调节血管平滑肌细胞增殖, 迁移和凋亡, 在血管动脉粥样硬化中发挥重要作用[31]; 差异性表达的lncRNA MEG8可能在病理性新生血管生成过程中起到重要调控作用, 可能参与婴幼儿血管瘤的血管生成[32].但是目前lncRNA MEG8在GC方面尚无研究报道. 本研究通过测定lncRNA MEG8在GC组织与其对应的癌旁组织中的表达量, 分析了两组间表达差异情况及与临床病理因素相关性, 结果显示lncRNA MEG8在GC组织中的表达明显低于癌旁组织, 差异具有统计学意义(P＜0.05);MEG8的表达与患者年龄及临床分期相关(P＜0.05), 临床分期越高, MEG8在GC组织中的相对表达越低, 以上研究结果提示MEG8可以作为GC诊断的潜在靶点, 为GC诊断提供新思路.

mRNA TGM2是转谷氨酰胺酶家族成员之一, 通过钙依赖性酰基转移反应(转酰胺化)催化蛋白质的特异性翻译后修饰. 此外, 该酶显示出多种酶活性, 例如鸟嘌呤核苷酸结合和水解、蛋白激酶、二硫键异构酶活性, 并参与细胞粘附. 是参与肿瘤发生各个阶段的关键酶之一. 在癌症干细胞上皮-间质转化, 细胞凋亡、分化以及侵袭性转移表型形成中起重要作用[33]. 已有研究显示TGM2在消化道肿瘤中发挥重要作用, TGM2通过的Wnt/β-catenin的通路调节血管生成, 干扰结肠癌细胞凋亡[34]. TGM2在GC血管内皮细胞中上调, 新型肽GX1可以通过直接结合TGM2抑制血管生成, 从而抑制其下游途径(NF-κB/HIF1α)[35]. TGM2在食管腺癌中过表达, 并与肿瘤分期分化相关[36]. 本实验检测TGM2在GC及癌旁组织中表达具有显著差异, TGM2在GC组织中的相对表达量明显高于癌旁组织(P＜0.05), 表达差异与GC分期相关, 与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、转移情况无明显相关. TGM2在GC及癌旁组织表达差异结果与Oncomine数据库中其在GC及正常胃黏膜组织的表达差异性相似, 并分析85例GC患者TGM2的表达情况与患者生存时间的关系, 发现随访时间超过30个月时, TGM2高表达患者的生存率较低表达患者略高, 但无统计学差异(P= 0.607,P＞0.05). 有研究表明高表达的TGM2是肿瘤存活的一个因素[37], 本次研究结果并没有体现, 由于本研究纳入样本量较小, 需要进一步行大样本研究进行验证. 综上所述, TGM2在GC组织中的表达相对癌旁组织明显升高, 可作为GC诊断潜在分子标志物, 其表达情况对于GC患者预后意义有待进一步大样本统计研究.

本研究仍存在不足, 因为包括的患者例数相对偏少, 基因相对表达量离散程度较大, 初步获得的结果可能并不能准确反映其在GC中的表达情况, 需要在大样本中重复验证; 其次, 本次实验仅局限于组织表达分析,未能体现细胞及动物层面研究, 基因在GC中的作用机制需进一步实验完善验证. 近年来虽然GC发生率较前有所改善, 但由于中国人口基数大, 且GC初期临床症状不典型, 仍面临巨大的癌症防治压力, 迫切需要发现新的分子标志物, 为GC的防治提供机会.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer, GC)是世界范围内的一种重要癌症,尽管在过去几十年中GC事件的发生率有所下降, 成为第五位最常见的癌症, 依然是影响全球健康的一个主要问题. 2018年GC新增病例超过100万例, 估计有78.3万例死亡, 成为全球第三大与癌症相关的死亡原因. 新病例确诊后5年存活率仅达28.3%. GC是一个多方面因素综合作用、长期积累的最终结果, 这一发生发展过程甚至需要经过几十年, 其发病机制涉及许多基因、分子信号通路及表观遗传学变化. 从分子水平上了解GC相关基因表达水平及调控模式是十分有必要的, 结合现在热门的基因靶向治疗理念, 将对GC的诊断、治疗以及预后等方面提供重要依据.

实验动机

本研究主要探究GC与GC相关基因的表达及临床意义.通过阅读文献及应用生物信息学分析, 筛选出可能在GC中有表达意义的分子MEG8及TGM2. 通过聚合酶链式反应检测基因在GC组织及其癌旁对照组织中的表达情况, 比较表达差异性, 进一步联系临床因素分析MEG8与GC患者临床病理因素相关性, 为GC的诊治及预后研究提供潜在的分子标志物.

实验目标

由于GC严重威胁人类健康, 且预后差, 本研究通过实验检测相关基因在GC及其对应的癌旁组织的表达情况,分析基因表达与GC临床病理因素相关性, 以及基因表达与GC患者预后相关情况, 旨在为GC研究通过新生物标志物.

实验方法

收集GC、及癌旁组织标本; 待样本离体后, 立即置入RNA样本保存液中, 送至实验室, 置4 ℃冰箱过夜处理后, 置入-80 ℃冰箱冻存; 经过组织RNA提取、逆转录等过程, 通过PCR检测MEG8、TGM2表达量, 统计分析GC组织与癌旁对照组织间存在表达差异(P＜0.05), 记录、汇总实验数据, 完善患者信息(年龄、性别、肿瘤分期、分化程度、有无淋巴结转移及有无远处转移),运用统计学方法分析实验结果意义所在, 是否与年龄、性别、临床分期、远处转移等存在关联性, 分析TGM2表达与GC预后的关系及意义.

实验结果

本篇论文实验结果基本符合假设目标, 通过检测基因在GC及癌旁组织中的表达情况, 发现MEG8在GC组织中表达低于癌旁组织, 可能成为GC诊断潜在靶点; TGM2在GC组织表达高于癌旁组织, 但并未发现TGM2表达与GC患者预后情况有显著意义.

实验结论

本次研究首次发现MEG8在GC及癌旁组织中表达具有统计学差异, 发现MEG8、TGM2在GC组织中表达与GC临床分期具有相关性, 可能为GC诊治及预后提供潜在生物标志物.

展望前景

本研究初步探讨MEG8在GC及癌旁组织中具有表达差异性, 但其在GC发生、发展过程中的作用机制尚不清楚, 急需进一步实验研究证明, 为GC的诊治提供新的研究思路及靶点; TGM2在GC发生机制已有相关研究, 其表达情况与GC患者预后相关性需收集大样本进一步统计分析, 为GC预后提供判断依据.