尹秀梅,张敬东,王思宏
(1 延边大学药学院,吉林 延吉 133002;2 延边大学分析测试中心,吉林 延吉 133002)
天然提取物的许多有益健康的特性都归功于其中所含的抗氧化成分,因为抗氧化物质可以清除自由基,自由基会对人体造成一些有害影响,如DNA损伤、致癌和与衰老有关的细胞退化。由于消费者对食品中合成抗氧化剂的安全性的担忧,从植物提取物中开发天然抗氧化剂越来越引起重视。如何在靶向引导下从复杂的中草药体系中实现活性化合物的快速筛选和分离,一直是分离技术研究者努力解决的重要课题。红景天属植物约20种被用作亚洲的传统抗氧化中草药,其中的咖啡酸、黄酮类物质、酚类和多酚类化合物都具有较强的抗氧化能力,能有效的清除机体内外的自由基,但是一些亚种的红景天化学成分尚未得到深入研究[1-2],长白红景天(R.angustaNakai)[3]根茎叶中黄酮含量及其抗氧化活性研究尚未见报道。鉴于磁性材料的超顺磁性、材料整体的制备简单性、应用低毒性等特点,磁性材料在分离富集领域中,作为一种应用与研发潜能的固相萃取材料,一直受到广泛关注[4]。因此从天然产物化学与材料化学的学科交叉出发,以长白红景天提取物为研究对象,采用硼酸功能化磁性材料[5]对长白红景天提取物进行配体垂钓,通过DPPH清除率来分析验证功能化磁性材料与提取物不同成分之间亲和作用力的差别。
长白红景天采自安图二道白河,经由延边大学药学院吕惠子副教授鉴定;三氯化铁、过氧化氢、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、甲醇、乙酸、乙酸钠、氯化铵、浓氨水(均为分析纯);芦丁, 中国生物制品检定所;DPPH,Sigma;钕铁硼强磁(50×50×10 mm),宁波永磁磁性材料厂;根据文献制备和表征硼酸功能化磁性材料(MNP-BOH)[4, 6]。
U-3400型紫外可见分光光度计,HITACHI公司;SHBⅢ型循环水式真空泵,上海豫康科教仪器设备有限公司公司;Q/BKYY31-200型电热恒温鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂;RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;TWIN MIXER TM-282振荡器, ASONE。
新鲜的全株长白红景天置于烘箱中, 60 ℃烘 24 h 后,粉碎过 60 目筛。称取 1.00 g 长白红景天干粉,加入 20 倍体积 70% 乙醇,于80 ℃ 水浴回流 3 h,过滤,残渣重复上述操作1次,合并 2 次提取物,转移至 100 mL 容量瓶中,用 70% 乙醇溶液定容至刻度。
芦丁0.0530 g,置25 mL容量瓶中,用70% 乙醇适量加热溶解,得浓度为2.12 mg·mL-1对照品溶液。量取对照品溶液0、0. 5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL分别置于25 mL容量瓶中,然后依次加5% 亚硝酸钠溶液(1.0 mL), 10% 硝酸铝溶液(1.0 mL), 4% 氢氧化钠溶液(10.0 mL),最后用 70% 乙醇稀释至25 mL,置比色皿(2.0 mL)中,在波长510 nm处测定不同浓度的对照品吸光度。用origin软件作图,得到回归方程。长白红景天提取物2.5 mL,同芦丁配制方法一样,在波长510 nm处测定长白红景天提取物吸光度。通过对照品回归方程计算出长白红景天提取物黄酮浓度,从而得到长白红景天提取物中黄酮含量。
2.3.1 缓冲溶液配制
pH=3.6缓冲液:0.51 g乙酸钠,加乙酸2 mL,再加水稀释至25 mL;pH=8.5缓冲溶液:0.80 g氯化铵溶于水,加176 μL 浓氨水,稀释至10 mL。
2.3.2 磁性吸附
将MNP-BOH与长白红景天提取物混合后孵化,进行磁性吸附。2 mL离心管中,加入200 μL长白红景天提取物,1800 μL MNP-BOH缓冲液,在漩涡振荡器上振荡10 min,放置于钕铁硼强磁磁场中,将清液小心取出,然后用1 mL的乙醇浸洗MNP-BOH,在漩涡振荡器上振荡10 min后放置于钕铁硼强磁磁场中10 min,将清液小心取出,重复2次。
2.3.2 磁性解离
MNP-BOH浸泡在pH=3.6缓冲液(100 μL),超声振荡20 min,70% 乙醇溶液(1900 μL)中,在振荡器上振荡30 min,解离与磁性材料特异性吸附的成分,然后放置于钕铁硼强磁磁场中10 min,清液即为长白红景天的配体垂钓液。
测定按参考文献[7]进行,并计算清除率。
以吸光度为纵坐标,芦丁浓度为横坐标,得到回归方程为:Y=0.15463+1.10923X,R2=0.9987,线性范围为0.0424~0.508 mg·mL-1。依据获得的回归方程,计算得到长白红景天提取物中黄酮含量,结果为 49.6 mg·g-1,如表1 所示。
制备的MNP-BOH平均粒径为70 nm,饱和磁化强度值为50.6 emu·g-1,具有较强的磁性,满足磁性分离的磁性要求。
表1 长白红景天提取物中黄酮浓度
长白红景天提取物对DPPH清除能力测定结果,如图1所示。长白红景天提取物在500 μL(0.248 mg·mL-1)时,清除率达到90.34%,在0~0.248 mg·mL-1范围内,随着浓度的增加长白红景天提取物的DPPH清除率呈现递增趋势,高于0.248 mg·mL-1DPPH时,清除率变化不大。
图1 长白红景天提取物对DPPH清除率Fig.1 DPPH scavenging rate of Rhodiola angusta Nakai extract
500 μL(0.248 mg·mL-1)长白红景天提取物,分别使用5、10、15、20和25 mg不同的MNP-BOH用量进行磁性分离、洗脱、垂钓和测试DPPH清除率,对比结果见图2,从图2可以看到15 mg磁性材料,能使垂钓液的DPPH清除率的能力达到93.31%,这表明MNP-BOH中硼酸与长白红景天提取物中的含邻1,2-OH组分存在选择吸附作用。
图2 不同量磁性材料的DPPH清除率Fig.2 DPPH scavenging rate for different amount of magnetic materials
用15 mg MNP-BOH 对250 μL (0.124 mg·mL-1)、500 μL (0.248 mg·mL-1)、750 μL(0.372 mg·mL-1)长白红景天提取物,进行磁性分离、测试DPPH清除率,结果见图3。500 μL (0.248 mg·mL-1)长白红景天提取物,磁性分离前DPPH清除率 92.34%,磁性分离后提取物 DPPH清除率18.09%。磁性分离后的750 μL(0.372 mg·mL-1)长白红景天提取物的清除率与500 μL (0.248 mg·mL-1)的差别变小,说明MNP-BOH吸附饱和的倾向。
图3 磁性分离前后的长白红景天提取物的DPPH清除率Fig.3 DPPH scavenging rate for before and after magnetic separation of Rhodiola angusta Nakai extract
用 70% 乙醇提取长白红景天,以芦丁为对照品,采用紫外分光光度法测定长白红景天中黄酮含量。长白红景天提取物对 DPPH 有一定的清除能力,其浓度为 0.248 mg·mL-1时,清除率达到 90.34%,其清除作用随着浓度的增大而表现出明显的量效关系。用制备的MNP-BOH比较了长白红景天提取物的磁性分离前后的 DPPH 清除率变化,结果表明 MNP-BOH 能吸附长白红景天提取物中的含邻1,2-羟基组分,吸附物质有待日后下一步的富集和结构解析。