NDRG1通过上皮-间充质转化与子宫内膜样癌MELF浸润模式的相关研究

荆羽萌，赵海潮，白丽娜，肖虹，郑绘霞

(1.山西医科大学第一临床医学院，太原 030001； 2.山西医科大学第一医院病理科，太原 030001)

N-myc下游调节基因1 (N-myc downstream regu-lated gene 1，NDRG1) 是一种在多细胞生物中均高度保守的细胞质蛋白，广泛存在于人体多种组织中。NDRG1是N-myc下调基因家族的成员，属于α/β水解酶超家族。在涉及各种人类癌症的不同检测报告中均出现了NDRG1的表达失调[1-2]。绝大多数研究表明，NDRG1是一种转移抑制因子[2-4]。在结直肠癌中，NDRG1被认为是预后较好的预测因子，并可调节肌动蛋白细胞骨架重组，以抑制肿瘤细胞迁移[2]。子宫内膜癌是女性发病率和病死率均极高的恶性肿瘤，有数据表明，子宫内膜癌发病率居女性第四位，病死率居第五位，是危害女性健康的重大问题之一[5-6]。目前虽然采取以手术治疗为主的综合治疗，但效果并不尽如人意。晚期子宫内膜癌大部分发生浸润转移，导致患者预后不佳。而NDRG1作为一种转移抑制因子，能够调控肿瘤进展中不同的信号通路，导致主要转移相关功能的中断，包括上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、细胞骨架重塑以及肿瘤的迁移和侵袭[1,3]。一些有关NDRG1功能的分子通路并不明确，其靶点和伴侣分子仍需进一步探索。现就NDRG1通过EMT与子宫内膜样癌发生微囊性、延长性及碎片性(microcystic，elongated，fragmented，MELF)浸润模式的相关研究予以综述。

1 NDRG1表达的特异性

1.1人体NDRG1的表达 RNA印迹分析和原位杂交发现，正常人体组织中NDRG1在信使RNA水平上普遍表达[7-10]；当用免疫组织化学和蛋白质印迹分析时，一些器官组织(包括脑、心脏、卵巢、骨骼肌、结缔组织和血管)在信使RNA水平表达NDRG1，但在蛋白质水平不表达[10-11]。信使RNA和蛋白质水平之间的差异表明，NDRG1表达受转录和翻译水平的调节[10]。虽然NDRG1信使RNA在人体组织中普遍表达，但蛋白质以更具选择性的方式表达。NDRG1蛋白主要存在于上皮细胞中，在间质细胞和内皮细胞中未观察到。NDRG1在细胞中的定位很大程度上取决于组织类型，如在肠上皮细胞和哺乳期的乳腺组织中，NDRG1与细胞膜有很强的相关性，而在前列腺上皮细胞中其主要在细胞核中表达[11]。在其他组织类型(如肾的近端肾小管细胞)中，检测到颗粒状的细胞质和细胞核中的NDRG1蛋白[10]。考虑到NDRG1在各种组织中发挥多种生理功能，故不同的细胞定位可能与蛋白质的广泛功能有关。

1.2NDRG1的组织特异性功能 NDRG1基因对多种生物刺激做出反应，包括一氧化氮、细胞内Ca2+浓度、重金属离子(如Ni2+和Co2+)、缺氧、铁耗竭、雄激素、维生素A和维生素D3等[12-13]。虽然NDRG1普遍表达，但其可能具有组织特异性功能。NDRG1在睾丸和前列腺中的表达可能与蛋白质在生殖器官发育中的预期作用[13]以及对雄激素的反应有关[14]。在胎盘中发现的NDRG1表达，也可以通过其在滋养层分化和保护免受缺氧诱导损伤中的作用来解释[15]。Meng等[16]研究发现，NDRG1在胎盘植入过程中的蜕膜形成中起重要作用，且NDRG1的异常表达可能与流产有关。有学者发现，NDRG1表达与缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、妊娠特异性β1糖蛋白、增强子结合蛋白α、Y盒结合蛋白1和SMAD7的蛋白表达相关，并提出转录因子Sp1(specificity protein 1)与HIF-1α、CCAAT增强子结合蛋白α、Y盒结合蛋白1和SMAD7通过时间依赖性方式调节低氧状态下胶质瘤细胞中NDRG1的表达，以此进行低氧状态下的细胞保护作用[17]。NDRG1的表达和功能表明，其可能在正常生理学中发挥组织特异性和多效性作用。

1.3肿瘤中NDRG1的表达 与正常组织相比，肿瘤组织中可观察到NDRG1的异常表达，具体表现为表达上调或下调[18-22]。癌细胞中，这种异常的表达可能由于NDRG1在遗传或表观遗传水平上的调节[23-25]。已有研究证明，癌基因N-myc和C-myc可通过与NDRG1核心启动子的相互作用，降低其启动子活性，间接抑制NDRG1[22-23]。在神经母细胞瘤细胞中，组蛋白修饰因子赖氨酸特异性脱甲基酶1与N-myc/MYCN癌基因共同抑制NDRG1表达[26]。这表明，NDRG1在细胞中的定位可能取决于其在细胞中的功能，从而解释不同肿瘤中NDRG1的多效性。虽然NDRG1在绝大多数肿瘤(如膀胱癌)中高表达[27]，但在部分肿瘤中NDRG1表达下调，如胃癌[28]、结直肠癌[29-30]、宫颈癌[31]、卵巢癌[32]和前列腺癌[33]等。因此，NDRG1在不同组织中的表达存在争议。许多研究强调了靶向NDRG1在癌症中的治疗潜力[21，34-36]。NDRG1与多种癌症转移相关，其表现出多效活性，可抑制多种类型肿瘤的转移[35-36]。NDRG1的磷酸化和切割与其功能有关，虽然尚不清楚这些修饰是否在不同类型癌细胞中普遍或选择性发生，以及是否有助于其多效性[37]，然而已有学者在某些类型的癌症中报道了NDRG1的促癌基因作用[25,27,38-39]。因此，提出NDRG1的癌症特异性、多效性功能[18,25，40]。

2 NDRG1与EMT

2.1NDRG1抑制EMT 转移是肿瘤学中恶性肿瘤的特性之一，导致近90%的癌症相关死亡；癌细胞经历EMT以侵入基膜并转移到远处器官[41]。EMT是一种重要的生物学过程，参与了胚胎发育、组织重构和切口修复，同时还导致恶性肿瘤转移[42]。近年来，已经筛选出许多可抑制侵袭-转移级联反应过程的转移抑制基因[43]。NDRG1是一种生长和转移抑制因子，其已显示出作为抑制肿瘤转移治疗靶点的潜力[13]。NDRG1可以抑制EMT并导致肿瘤细胞具有更多的上皮表型，从而可能降低肿瘤细胞的侵袭能力[3]。一系列新的缩氨基硫脲抗癌药物已被证明可以通过HIF-1α依赖和非依赖性机制上调NDRG1[44-45]，并提供了有效治疗癌症转移的方法[46-49]。因此，进一步研究NDRG1通过抑制EMT抑制肿瘤转移的机制及药物标靶具有重要意义。研究表明，NDRG1通过抑制EMT介导其转移抑制作用[3]。

2.2NDRG1通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路抑制EMT TGF-β通路在诱导EMT中起重要作用，研究表明，NDRG1通过调节TGF-β通路，从而调节TGF-β对EMT的作用，由于EMT在转移-侵袭级联中起关键作用[50-51]，所以NDRG1调节TGF-β通路是介导肿瘤转移抑制作用的一种机制。NDRG1可以减少TGF-β诱导的细胞膜上上皮钙黏素(E-cadherin)和β联蛋白(β-catenin)的丢失；而在TGF-β存在的情况下，NDRG1过表达维持了细胞膜上的E-cadherin和β-catenin的表达[3]。此外，研究还显示了NDRG1表达对SMAD蛋白(如SMAD2和磷酸化SMAD3)的抑制作用[48]。由于SMAD蛋白在转录中起作用，激活参与EMT的关键基因(snail和slug等)[52]，这解释了NDRG1可通过snail和slug调节EMT的分子机制。已证明，NDRG1对snail和slug具有抑制作用，转录抑制E-cadherin[3]。因此，NDRG1可通过抑制TGF-β诱导SMAD信号转导通路来抑制EMT。研究显示，NDRG1在结肠肿瘤细胞中的过表达导致E-cadherin的表达上调，以此抑制EMT达到抑制肿瘤侵袭的作用[53]。Kovacevic等[48]发现，胰腺癌中NDRG1上调NEDD4L(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-like)和GLI样锌指蛋白类似物3，并通过TGF-β通路导致两个关键的肿瘤抑制蛋白上调，即人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和SMAD4的母体。

2.3NDRG1通过Wnt-β-catenin通路抑制EMT Wnt-β-catenin通路在EMT中也起至关重要的作用[54]。NDRG1可以抑制Wnt信号通路，这可能是影响EMT的另一种机制。Chen等[3]的研究证明，通过2，2-吡啶酮-4,4-二甲基-3-缩氨基硫脲(Dp44mT)可以上调NDRG1表达水平，以此阻断Wnt辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(low densitylipoprotein receptor related-protein，LRP)6的作用，从而抑制Wnt信号转导。有研究证明，NDRG1减弱了Wnt在结肠癌细胞中诱导EMT的能力，从而使上皮标志物(即细胞膜结合的E-cadherin和β-catenin)表达增加，EMT调节因子(如vimentin、fbronectin、twist和slug)表达下调[55]。此外，Jin等[55]一项研究表明，NDRG1可抑制DU145前列腺癌细胞和HT29结肠癌细胞中丝氨酸33/37和苏氨酸41处β-catenin的磷酸化，并升高质膜上非磷酸化β-catenin的水平；同时，NDRG1可通过抑制β-catenin的核转运来调节Wnt-β-catenin通路。

总之，NDRG1可以通过调节两种重要途径(即TGF-β和Wnt-β-catenin)影响EMT。Liu等[4]证明了肿瘤转移抑制基因NDRG1通过与Wnt受体LRP6相互作用，阻断Wnt信号转导，并通过对临床队列数据的分析表明，Wnt+/NDRG-/LRP+信号对于癌症患者的无复发生存具有很高的预测价值。此外，NDRG1可抑制磷脂酰肌醇-3-激酶和Ras致癌途径[48]。

3 MELF浸润模式

3.1MELF浸润模式的概念 MELF浸润模式是近年妇科病理学家发现的子宫内膜样腺癌的一种特殊浸润方式，其腺癌细胞呈微囊状、拉长裂隙样及碎片状浸润到子宫肌层，腺腔内衬细胞胞质呈嗜酸性，镜下呈现鳞状细胞样或扁平状类内皮细胞样[56]。MELF浸润模式的判读标准采用Murray等[56]描述的具体病理学表现：①由特征性腺体构成，这些腺体呈微囊状、拉长结构，呈挤压状，有时呈裂隙样；②肿瘤细胞具有明显的嗜酸细胞质、鳞状细胞或呈扁平状和类似内皮细胞样的细胞被覆于腺腔；③特征性腺体被水肿或黏液性基质包绕，常见炎症细胞，主要为中性粒细胞；④MELF浸润结构主要位于侵及子宫肌壁的癌巢。关于MELF浸润模式的临床病理特征研究发现，MELF浸润模式多发生于低级别子宫内膜样癌，与淋巴结转移、淋巴脉管间隙浸润及子宫深肌层浸润等不良病理因素相关[57-59]。

3.2NDRG1和EMT与子宫内膜样癌MELF浸润模式的联系 关于MELF浸润模式发生的具体机制目前尚未明确，有学者认为，MELF浸润模式是分化组织在形态学上的退行性改变[56]。有研究对存在MELF浸润模式的子宫内膜样癌肿瘤组织进行免疫组织化学检测发现，MELF浸润腺体中雌激素、孕激素受体表达缺失，E-cadherin、β-catenin、半乳凝素-3和Ki67的表达下调，细胞角蛋白19表达异常，而fascin、G1/S-特异性周期蛋白D1和p16的表达增加，上述这些变化更具体地将EMT与MELF浸润模式联系起来[60-61]。Zaino[62]观察到同样的结果，认为MELF浸润模式与雌激素和孕激素受体的表达相关。Kihara等[57]在52例高级别子宫内膜样癌患者中均未发现MELF浸润模式；在低级别子宫内膜样癌患者中，MELF浸润模式与肿瘤大小显著相关，子宫肌层浸润>1/2，同时伴有淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、乳头状结构和黏液分化；免疫组织化学分析显示，子宫内膜样癌MELF浸润模式中肿瘤细胞p16和p21呈阳性，而Ki67呈阴性，这表明MELF浸润模式中肿瘤细胞出现生长停滞、细胞衰老或EMT等现象。大量研究发现，伴有MELF浸润模式的子宫内膜样癌经常出现包括E-cadherin、β-catenin等EMT表型的变化，提示子宫内膜癌的MELF浸润模式与EMT可能存在某些潜在联系[60-63]。

MELF的变化与宿主基质反应(主要是纤维粘胶样反应)的存在和血管浸润有关[56]。有学者研究发现，MELF 浸润模式与子宫内膜样癌的临床分期、子宫肌层浸润程度、淋巴结转移、脉管瘤栓、淋巴血管间隙侵犯等因素相关[64]。研究表明，MELF浸润模式与NDRG1存在一定联系[61-63]。同时，NDRG1通过促进泛素化和蛋白酶体降解减少子宫内膜样癌细胞中caveolin-1蛋白的表达；此外，caveolin-1的表达介导NDRG1的改变，进而使肿瘤发生EMT和转移，并导致子宫内膜样癌发生MELF浸润模式[62]。

3.3其他组织中的MELF浸润模式 有研究发现，MELF浸润模式在其他上皮肿瘤中也可出现，如在胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤的周围也观察到类似的组织学特征；单因素分析显示，具有MELF样特征的胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤患者的整体生存率和疾病特异性生存率较低；同时，在高度不典型增生的胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤中，MELF浸润模式的腺体中常见SMAD4的缺失和p53的过表达[65]。在MELF浸润模式的肿瘤组织中可以观察到E-cadherin和β-catenin表达的变化，因此NDRG1对肿瘤细胞的上皮标志物(即膜结合的E-cadherin和β-catenin)产生抑制作用，以此抑制MELF浸润模式，但其相关机制还需要进一步验证。

4 NDRG1在肿瘤治疗中的应用

4.1针对NDRG1的靶向治疗 相关文献报道，铁螯合剂可消耗细胞摄取的Fe2+/Fe3+，从而导致NDRG1的表达显著上调[44-46]。同时也有文献报道了几种新型缩氨基硫脲铁螯合剂，如Dp44mT和Di-2-吡啶基酮-4-环己基-4-甲基-3-缩氨基硫脲(DpC)等，通过上调NDRG1显示出显著的抗肿瘤活性；特别是通过口服或静脉给药时，DpC明显抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，且耐受性良好，无明显的不良反应[3]。无论是在体外实验进行细胞系培养还是在体试验进行肿瘤移植，Dp44mT和DpC均可诱导NDRG1表达[46-49]。Liu等[4]的研究证明，NDRG1上调对于Dp44mT介导的体内转移抑制至关重要，且显示了NDRG1作为抗肿瘤新型药物的化学治疗靶点的重要性，并进一步证明了它们作为抑制肿瘤转移的靶点在临床治疗中的潜力。体外研究还表明，Dp44mT可以抑制TGF-β诱导的EMT，且能够在细胞与TGF-β共培养后维持细胞膜上E-cadherin和β-catenin的表达，Dp44mT对EMT的抑制作用可能是由于Dp44mT能有效上调NDRG1[3]。

4.2NDRG1的辅助治疗功能 Kim等[46]发现，NDRG1、ERBB受体反馈抑制剂1、H19、MPZL3(myelin protein zero-like protein 3)和尿路上皮癌相关1(urothelial carcinoma associated 1，UCA1)的RNA表达在耐放射性直肠癌细胞系中高度增加；另外，短发夹RNA介导的NDRG1沉默可使直肠癌细胞在暴露于放射线时引起更多DNA双链断裂，从而使放射线对临床相关剂量的放射致敏。Cen等[47]证明，NDRG1可以下调磷酸化信号转导及转录激活因子3、磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化蛋白激酶B、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9，并激活人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因，NDRG1的上调可能通过抑制信号转导及转录激活因子3和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路来显著减少胰腺癌的发生，在手术切除后抑制胰腺癌的转移和复发。同时，NDRG1被证明在缺氧条件下介导了对阿霉素的抗性，表明NDRG1在这些条件下对细胞存活的作用，并发现在常氧下表达NDRG1短发夹RNA的阿霉素处理的细胞凋亡减少，提示在正常氧气压力下乳腺上皮细胞凋亡中NDRG1的需求[66]。

5 小 结

NDRG1在正常人体中广泛表达并存在组织特异性。而在癌细胞中，NDRG1可调节肌动蛋白细胞骨架重塑，以抑制肿瘤细胞迁移。NDRG1是抑制肿瘤侵袭和转移的重要治疗靶点。通过上调NDRG1来抑制肿瘤细胞转移的新型缩氨基硫脲化学治疗剂已在逐步开发，显示出可以进行靶向癌症治疗的潜力。由于子宫内膜样癌的EMT导致其发生MELF浸润，进而导致癌症转移，因此可以靶向NDRG1进而通过TGF-β通路或Wnt-β-catenin通路抑制肿瘤的发生、发展，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。总之，为了将NDRG1作为药物靶标开发，需要进行广泛的研究，以了解该蛋白质抑制肿瘤侵袭和转移的活性，并明晰其详细的分子机制。