急性肺损伤的表观遗传学研究进展

詹兰，黄强

(四川大学华西医院科研基地科，成都 610041)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)第一次被发现并定义是在1967年[1]。ARDS的特征主要是过度的肺内炎症反应、肺泡毛细血管屏障破裂和肺水肿，进而导致气体交换的严重受损[2-3]。ARDS被认定为呼吸领域的一个重要的临床问题，既往众多防治手段(如重症监护医学的进步和肺保护性机械通气)降低了ALI/ARDS的发病率和病死率，但更多的治疗方法和研究方向亟待发现和发展[4]。不同于经典遗传学，在不同的机体中也存在一些不能用孟德尔遗传定律解释的遗传表型变异的例子。除DNA序列外，一些不涉及基因结构变化的遗传决定因素也可以传递给下一代，如DNA的共价化合修饰、组蛋白的翻译后修饰和各种非编码RNA[5]。这些遗传因素包括其他一些叠加在DNA序列上并赋予细胞特异性功能的调节因子，通常被称为表观遗传因素[6]。目前，一些常见的呼吸疾病(如哮喘[7]、慢性阻塞性肺疾病[8]和肺动脉高压[9])已有相关综述，但关于ALI/ARDS的表观遗传学研究少有报道。现就ALI的表观遗传学研究进展予以综述。

1 DNA甲基化与ALI

在哺乳动物基因组中，DNA甲基化是一种主要的表观遗传机制，即在DNA甲基转移酶的作用下将甲基转移到胞嘧啶的C5位置，形成5-甲基胞嘧啶，进而募集参与基因抑制的蛋白质或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达[10]。正常的DNA甲基化对于机体的很多正常功能(如X染色体失活、细胞分化、胚胎发育等)都是必需的。异常的DNA甲基化在过度炎症反应的病理生理学中起着至关重要的作用[11]，它不仅与肿瘤相关[12]，在常见的呼吸系统疾病中也可能起着重要的作用[13-14]。

McGrath-Morrow等[15]研究发现，由肺炎导致的小儿ALI病死率高达20%，发病率甚至与癌症相当；另外，新生小鼠(3～4 d)和幼年小鼠(11～14 d)同时用大肠埃希菌经吸入感染，新生小鼠病死率更高；且相对于新生小鼠，幼年小鼠的一系列T细胞免疫应答基因被上调，而用地西他滨抑制DNA甲基化可以诱导肺CD4+T细胞标志物产生，说明CD4+T细胞通路关键基因启动子内的DNA甲基化在新生儿肺炎免疫反应低下时有重要作用，DNA甲基化可能作为小儿肺部感染和损伤修复治疗的靶标。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptors γ，PPARγ)是核激素受体家族中的配体激活受体，可以诱导下游合成抗氧化产物而产生抗炎、抗氧化作用。PPARγ的激活可以对百草枯中毒导致的大鼠ALI发挥保护作用[16]。DNA甲基化通常与基因表达的抑制相关，细菌脂多糖可以通过诱导PPARγ的异常甲基化导致PPARγ表达降低，Lei等[17]在动物和细胞实验中证明，抑制脂多糖诱导的PPARγ启动子甲基化可缓解ALI的病情。另外，一项关于脂多糖诱导的大鼠ALI肺组织DNA甲基化的全基因组分析比较了甲基化水平和CpG岛密度，发现与高CpG岛密度启动子相关的基因甲基化率较高，进一步说明异常的DNA甲基化可能与ALI/ARDS的病理进程密切相关[18]。

烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成的限速酶，与细胞的代谢密切相关[19]。已有研究表明，NAMPT是一种新型ARDS治疗靶标和候选基因，可能通过表观遗传转录调控以应对过度的机械应激[20]。研究证明，过度的机械应力或脂多糖处理均可导致肺动脉内皮NAMPT启动子DNA甲基化水平降低和基因转录增加[21]。关于治疗方面值得注意的是，DNA甲基转移酶抑制剂可以通过增加肺部调节性T细胞的量减轻实验性肺损伤[22]，这对于将表观遗传学的治疗途径应用于ARDS有新的启发。

2 组蛋白修饰与ALI

蛋白质的翻译后修饰对蛋白功能调节十分重要，是蛋白质组复杂性的原因之一。而组蛋白作为染色质的重要组成成分，对于其修饰研究也至关重要。DNA和组蛋白构成了染色质的主要成分，而紧密的染色质结构很大程度上是由带有相反电荷的两者相互吸引所维持的。与其他蛋白相同，机体可能会对组蛋白进行乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻译后修饰，其中组蛋白乙酰化会使蛋白电荷发生变化，导致组蛋白与DNA的结合变弱，从而利于转录因子和DNA结合激活转录。组蛋白乙酰化一般由组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶两种酶调控，乙酰化和去乙酰化的失衡可能会引起多种疾病。有研究发现，脂多糖可导致NAMPT启动子DNA甲基化水平降低和基因转录增加，同时也发现通过曲古抑菌素抑制组蛋白去乙酰化可以减轻脂多糖导致的NAMPT表达增加，说明表观遗传的各种修饰方式不是完全相互独立的，也有可能相互影响[21]。此外，表面活性蛋白B是一种肺泡中降低表面张力的蛋白质，其减少与肺损伤密切相关，Bi等[23]研究发现，NAMPT的下调可提高表面活性蛋白B的表达，并恢复肿瘤坏死因子-α诱导的表面活性蛋白B的抑制；另外，NAMPT的过表达还会抑制人腺癌细胞中的表面活性蛋白B表达，而抑制NAMPT是通过增强组蛋白乙酰化来增加表面活性蛋白B转录而上调表面活性蛋白B表达的，表明特异性地敲低肺泡上皮的NAMPT可能是ALI/ARDS潜在的、可行的表观遗传治疗手段。

在由缺血再灌注诱导的肺损伤体内模型中，曲古抑菌素A可以浓度依赖性地缓解缺血再灌注导致的血管通透性、肺水肿、肺动脉压和肺组织学变化，这一过程可能是通过增加组蛋白乙酰化和促分裂原活化的蛋白激酶磷酸酶1的表达，抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶和凋亡信号通路实现[24]。临床上，脓毒症常导致ALI，体内实验表明，组蛋白去乙酰化酶对于脓毒症相关ALI也具有治疗作用，与实验组相比，曲古抑菌素A和丁酸钠可减少盲肠结扎和穿刺导致的肺损伤小鼠的中性粒细胞浸润、细胞间黏附分子1和E-选择素的表达以及血浆中白细胞介素-6的水平，表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂基于调节与乙酰化修饰相关的关键酶，有效地减弱了肺内炎症反应[25]。

肺纤维化是一种以成纤维细胞大量异常增殖及细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，是ALI/ARDS发展的重要病理阶段。研究发现，胸腺细分化抗原1(thymocyte differentiation antigen 1，Thy-1)在正常的肺成纤维细胞表面大量表达，但在特发性肺纤维化患者的肺组织中可能会呈阴性表达；脂多糖可以通过其特异性受体Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)降低Thy-1基因启动区的组蛋白乙酰化水平来抑制Thy-1的表达，从而引起相关病理变化和进程[26]。内皮素1是一种由21个氨基酸组成的可以影响血管张力的多肽，ALI/ARDS患者内皮素1明显升高[27]。而Lin等[28]研究发现，内皮素1可能通过组蛋白乙酰转移酶p300引起组蛋白H4的乙酰化，并可能由此导致病理性炎症的发生和放大，表明内皮素1可能是ALI/ARDS的一个新型表观遗传标志物和治疗靶标。另外，p300的活性与癌症和炎症性疾病密切相关，可与组蛋白去乙酰化酶1共同调节视黄酸相关孤儿受体γt，Chen等[29]从临床和脂多糖诱导的ALI小鼠模型两方面研究证明了组蛋白乙酰转移酶p300可调节视黄酸相关孤儿受体γt的转录，在ARDS中起着重要作用，可能是ARDS的潜在新的免疫治疗靶标。

3 非编码RNA与ALI

非编码RNA是近年来的研究热点，仅有少量非编码RNA包含较小的开放阅读框，可以编码功能性的多肽[30]，多数非编码RNA不编码蛋白，但可以调控基因的表达，参与各种重要的生理过程。非编码RNA根据大小的不同可以分为两类：小非编码RNA(<200个核苷酸)，包括微RNA(microRNA，miRNA)和Piwi交互RNA；长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)(>200个核苷酸)，包括长基因间非编码RNA、环状RNA (circular RNA，circRNA)、天然反义转录物和增强子RNA[31]。

miRNA广泛分布于各种生物中，目前已经在人类基因组中发现多个miRNA和其对应的靶基因，说明miRNA在全基因组的表达中起重要作用。miRNA是非编码RNA中研究较早和较多的一个，通过对靶基因的转录后沉默，调节基因的表达，miRNA涉及多种疾病过程的生理和病理功能[32]。miRNA在炎症或细胞凋亡中发挥重要作用，而炎症和细胞凋亡是ALI/ARDS的常见特征，所以miRNA可能是ALI/ARDS的诊断指标和治疗靶点[33]。目前，许多特异性miRNA(包括miR-1246、miR-494、miR-339-3p)已被证明可以通过各种方式影响ALI/ARDS[34-36]。

TLR4可以激活下游相关炎症通路，是NF-κB信号通路的重要调节因子。近年一系列研究证明miRNA可以通过TLR4影响ALI/ARDS的病理进程，如Yang等[37]研究发现，提升miR-140-5p的表达可以通过TLR4调节髓样分子88影响NF-κB信号通路而抑制炎症因子释放；Ju等[38]研究发现，miR-27a也可以调节TLR4/髓样分化因子88/NF-κB通路；此外，miR-140、miR-146a、miR-181a同样通过TLR4通路影响ALI/ARDS在炎症中的应答[39-42]。Li等[40]研究发现，与对照受试者相比，miR-140在ALI患者的外周血中减少；进一步动物实验发现，miR-140在ALI大鼠的血浆和肺中均减少，且通过双荧光素酶报告基因测定表明TLR4是miR-140的靶基因，提示TLR4可能是众多ALI相关miRNA的重要靶分子。而在不同的个体研究中证实，对应治疗后患者体液中的miRNA水平可以回到基线，进一步提示miRNA作为生物标志物的潜力[43]。

目前为止关于lncRNAs的研究相较于miRNA较少，与miRNA相同，lncRNAs功能丰富，包括参与信使RNA剪接、降解和染色质修饰等。肺纤维化是ALI/ARDS发展的重要病理阶段，近年来有研究着重于lncRNAs和肺纤维化的研究，几个可能涉及特发性肺纤维化的miRNA被发现与lncRNAs的表达呈负相关性，而通过调节miRNA的表达，lncRNAs可能影响上皮间充质转化、成纤维细胞增殖和胶原表达，进而影响肺纤维化[44-46]。过表达lncRNA-p21可以显著抑制组蛋白Thy-1启动子区域的组蛋白H3和H4的乙酰化以及Thy-1的表达，说明在ALI/ARDS的病理进程中，lncRNA-p21可能通过抑制Thy-1的表达而导致肺纤维化[47]。

lncRNAs和miRNA在生物体内的功能并不是完全独立的，对ALI的影响也是如此。 内源竞争性RNA假说揭示了RNA之间新的作用机制，该机制最早是由Salmena等[48]于2011年提出的，miRNA可以靶向特定的编码基因导致基因沉默，从而导致蛋白表达降低，而内源竞争性RNA可能含有多个miRNA的结合位点，可以充当miRNA海绵，对大量的miRNA进行吸附，导致miRNA对原本的靶基因的抑制得以缓解。Li等[49]研究发现在脂多糖诱导的细胞和动物模型中，lncRNA-CASC2(cancer susceptibility candidate 2)的表达均显著低于正常组，而miR-144-3p表达与lncRNA-CASC2相反；同时，水通道蛋白1的表达与miR-144-3p呈负相关，荧光素酶报告基因测定显示，水通道蛋白1是A549细胞中miR-144-3p的靶标，lncRNA-CASC2通过调节miR-144-3p控制水通道蛋白1的表达。而在脂多糖诱导的人肺纤维化细胞模型中，lncRNA-HAGLROS(HAGLR Opposite Strand LncRNA)通过调节miR-100参与细胞的凋亡和自噬，进一步引起机体的炎症损伤[50]。另外，与miRNA相同，lncRNAs也有作为生物标志物的潜力，Wan等[51]研究显示，患者血浆中的lncRNA-白细胞介素-7受体显著低于正常对照者，说明lncRNA也可能作为诊断ARDS的新型生物标志物。作为一类特殊的长链非编码RNA，circRNA是近年的研究热点，与lncRNA相同，circRNA也可以充当miRNA海绵。随着测序技术的进步，针对circRNA的测序分析促进了circRNA通过circRNA-miRNA-信使RNA网络调节基因表达作用的研究。Wan等[52]对脂多糖诱导的ALI大鼠进行测序分析，构建了circRNA表达谱，发现了大量异常表达的circRNA，并预测了可能结合miRNA，提示circRNA作为ALI/ARDS的新型生物标志物和充当miRNA海绵作用的潜力。

4 小 结

虽然ALI/ARDS的治疗目前已取得了明显的进步，但预后并不乐观，即使在2010年后，ARDS患者的住院、重症监护室、28/30 d、60 d的总病死率分别为45%、38%、30%和32%[53]。ALI/ARDS的发病机制仍有待明确。随着对ALI/ARDS表观遗传学研究的深入，越来越多的研究证明了表观遗传变化与ALI/ARDS的密切联系，表观遗传学在ALI的发病机制中扮演着重要角色。研究进一步加深了人们对ALI发病机制的认识和理解，但仍需要更深入的研究(包括表观遗传研究)来为ALI的诊治提供更加多样和可靠的表观遗传策略。