OTA对肝脏线粒体氧化应激的研究进展

◆作者：龚焘 陈建颖 王文策

◆单位：华南农业大学动物科学学院/广东省动物营养调控重点实验室；岭南现代农业科学与技术广东省实验室

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）由曲霉菌属和青霉菌属等多种真菌产生，是自然界中分布最广泛的一种赭曲霉毒素，也是食品和饲料中最常见的污染物之一（Mobashar等，2012），普遍存在于谷物及其副产品、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、混合饲料等食物及饲料中（Ringot等，2006）。此外，某些中草药、食品着色剂乃至瓶装水中也检测出含有OTA（Tao等，2018）。OTA可导致机体的肝脏、肾脏、神经系统和免疫系统等发生毒性病变（高翔等，2005），对人和动植物影响巨大（韩铮，2011）。OTA能同血浆白蛋白高度结合，这使得OTA血浆半衰期较长。在人体内，OTA半衰期长达1个月（陈凤鸣等，2019）。由于OTA的广泛存在性和高的热稳定性，使得从食物链途径根除OTA变得非常困难（Frantisek等，2016）。

OTA在动物组织中的分布，虽然受毒素数量、摄入方式、饮食结构和机体的整体健康状况等多种因素影响，但其主要的作用靶点是肾脏和肝脏（Pohland等，1992）。通过对猪、大白鼠、鸡以及山羊组织内OTA分布情况及各器官免疫荧光分析发现，OTA广泛存在于肝、肾、脾、心肌、肌肉、肠管等组织，且在肝细胞和肾小管基底膜中残留最多（原维，2009）。由于OTA半衰期较长，是积累型有毒化合物，因此对机体肝脏有持续的毒性影响。

肝脏是机体内最重要的器官之一，其内富含线粒体，其结构和功能的稳定性均决定着机体的健康程度。然而越来越多的研究表明，OTA可诱导肝脏线粒体氧化损伤，导致机体稳态失衡、疾病发生，给畜禽业造成巨大经济损失。鉴于此，本文综述了近年来OTA对肝脏线粒体氧化损伤的研究报道，以期为OTA的深入研究和减少其带来的损失提供理论基础和参考。

1 OTA的危害

1.1 OTA的饲料污染状况

一般情况下，OTA饲料污染比食品污染严重。1979年北美3%左右的OTA污染物浓度高达20000～30000μg/kg，1983年 美国等13个国家的饲料OTA污染最高可达30%（丁平等，2010）。敖志刚等（2008）检测发现，黑龙江等十个省市的多类饲料原料及饲料样品的赭曲霉毒素含量达95.1%。程传民等（2014）通过调查检测2423份样品的OTA检出率，证实了OTA污染的普遍性，其中以玉米、小麦及它们的副产物的检出率最为严重，均在80%以上。OTA被动物摄食后会在体内蓄积，并随食物链进入人和其他动物体内，危害其健康（Pattono等，2011）。Holmberg等（1990）通过6年的调查发现：猪肾脏、肝脏、脂肪、血液中的OTA残留量取决于饲料中OTA的浓度，饲料中OTA浓度越高，残留量也越多。同时发现，猪血清的OTA的污染程度也与不同季节收获的大麦湿度有关，湿度越大污染程度越重。因此，我们可以检测血液中OTA的浓度，来预估整个猪群OTA的摄入量，从而通过调节饲喂等方法，减少OTA的污染。据报道，正常情况下，植物性食品中OTA的平均浓度为0.1～100 μg/kg；干草和青贮饲料中OTA浓度为1～100μg/kg；动物性食品和饲料OTA浓度为0.1～1 μg/kg（Vladimir等，2015）。可见，OTA在畜牧业中的污染相当普遍。

1.2 OTA对家禽的毒性

家禽养殖业作为畜牧业的一部分，深受OTA的危害。OTA可抑制家禽肾脏、免疫及造血系统的生理功能，使肝糖原积聚、肝脏苍白褪色，引起钙和磷吸收不全、骨骼脆弱、生长受阻等，导致家禽孵化率降低、肝细胞坏死、肾病、病死率增高等（欧阳增理等，2012）。Aravind等（2003）研究表明OTA能抑制家禽的采食和生长，并加大病死率。Sakthivelan等（2010）试验也证实了OTA能抑制肉鸡的生长，并显著降低饲料消耗量和饲料转化率。Stove（2010）对5 ppm OTA饲喂2周的雏鸡进行组织病理学检查，发现OTA可引起大脑水肿、骨髓肌肉出血，并导致大脑、肾脏、肝脏和淋巴器官发生退行性变化。Pozzo等（2013）通过给雄性肉鸡饲喂每千克添加0.1mg OTA的日粮发现，OTA可造成脾脏、法氏囊和肝脏的退行性病变，诱发脂质过氧化反应。OTA不仅会降低肉鸡饲料消化率，提高料重比，还会导致蛋鸡蛋壳变薄，产蛋数减少。为此，欧洲食品安全局在2006年规定，谷物和谷物类饲料原料中OTA含量不得超过250μg/kg、每千克家禽日粮中OTA含量不高于100 μg/kg，中国饲料卫生标准（2017）也规定谷物及其加工产品和配合饲料中OTA含量不可超出100μg/kg（黄珂等，2019）。

2 肝脏线粒体氧化应激

氧化应激通常指活性氧浓度超过机体抗氧化防御系统承受范围的非正常状态，可导致机体衰老和疾病的发生（段圆慧等，2010）。氧化应激产生的自由基主要有RNS（Reactive Nitrogen Species）和ROS（Reactive Oxygen Species），这些自由基可导致机体氧化损伤。有研究证实，细胞凋亡会影响肝脏的正常代谢功能，诱发多种肝脏疾病（蒋志慧，2013）。同时，扰乱肝脏线粒体自由基代谢，会促进肝脏部分促凋亡基因的表达（庄煜，2013）。

肝脏是机体负责物质代谢和生物转化的主要器官，是代谢和解毒的重要场所。肝脏中含有大量的线粒体，一旦其结构或功能受损，会严重影响细胞能量代谢，导致肝细胞坏死、凋亡等（Khan等，2006）。同时，线粒体作为细胞的“动力源泉”，不仅是细胞内产生ROS的主要位点，还是氧化损伤的主要靶标。当机体内发生氧化应激时，线粒体最先也最容易受到攻击。在正常生理条件下，线粒体能够维持自身的氧代谢平衡，并通过ROS来调节机体的生理生化代谢。线粒体内ROS浓度不同，所发挥的作用也有所不同。低浓度的ROS，可维持体内氧化还原的平衡，并负责把信号隔离传导到细胞的其他隔室，是氧化还原信号分子。但当ROS浓度过高，超出机体的调节范围时，就会导致机体氧化受损。而过高浓度的ROS会氧化损伤mtDNA，诱发线粒体基因突变，同时促进ROS的生成，导致恶性循环，造成线粒体持续和强烈的氧化损伤，从而造成机体稳态被打破、细胞凋亡。

3 OTA诱导的肝脏氧化损伤

3.1 OTA引起肝氧化损伤的作用机制

3.1.1 OTA通过线粒体途径导致肝氧化损伤

OTA最先引起线粒体功能的紊乱，导致线粒体损伤。研究发现，OTA可以通过抑制线粒体内磷酸盐转运，引起大鼠肝脏细胞的呼吸抑制，造成ATP消耗并导致线粒体形态变化(Ringot等，2006)。Bouaziz等（2008）探究表明，OTA可诱导线粒体的凋亡通路，引起线粒体跨膜电势消失，促进细胞色素c释放并产生O2-，最终导致细胞凋亡。Golli等（2009）研究也证实了这一发现，并认为OTA可降低线粒体的膜电位，提高半胱天冬酶的活性。可见，OTA可以通过激活线粒体凋亡途径来诱导肝损伤。

线粒体呼吸链活性受阻、衰老或疾病时，会引起细胞大量产生和积聚ROS，从而导致氧化损伤。Jornayvaz等（2010）研究表明，线粒体ROS可促进线粒体DNA转录，加快线粒体的生物合成，造成持续损伤。刘静等（2012）研究者也认为，OTA可通过扰乱线粒体呼吸链功能，引起ROS生成量增加，对线粒体结构造成进一步损伤，并促进线粒体生物合成，使线粒体氧化损伤越发加剧，再次加速自由基的生成，从而对肝细胞造成进一步的氧化损伤。

此外，OTA还会加大线粒体膜的通透性、激活JNK和MAPK通路并对内质网钙通道造成影响（Liye等，2017；Sheu等，2017）。内质网是维持钙稳态的庞大膜质网络，负责多种蛋白质的合成、成熟和转运。当内质网功能受损时，会引起内质网腔中的Ca2+大量释放，造成线粒体钙超载，最终导致线粒体氧化应激的发生(Egnatchik等，2014)。

3.1.2 OTA通过影响酶活性诱导肝氧化损伤

OTA诱导的肝脏氧化损伤还 与SOD（Superoxide Dismutase）、CAT（Catalase）和GR（Glutathion Reductase）等还原酶活性有关。Abdel-Raheim等（2001）研究发现，OTA对肝、肾组织中谷胱甘肽还原酶有明显的抑制作用，组织中存在的OTA可能与SOD分子中的铜和锌相互作用并抑制酶的活性；OTA处理的CAT活性降低，可能反映了该酶活性所需的必需元素的吸收减少；在OTA暴露下，肝脏和肾脏GR活性下降，OTA可能通过与半胱氨酸残基的巯基结合而影响GR的活性。Gagliano等（2006）研究发现，OTA可使大鼠肝脏中SOD的含量显著升高。此外，其研究还表明，在OTA暴露后，肝脏和肾脏GSH（Glutathion）水平显著下降，而GSH水平降低会导致脂质过氧化降解减少，导致其积累，从而放大OTA的毒性。Zhang等（2013）在对Zn2+与肝细胞共培养过程中也发现，OTA可促进ROS的生成，并降低ROS活性和CAT mRNA水平，进而导致氧化损伤。可见，OTA可通过抑制SOD、CAT、GR等酶活性，降低GSH的表达水平等方式，间接导致肝氧化损伤。

此外，NADPH-CYP450还原酶可将OTA复合物中Fe3+还原为Fe2+，并产生自由基，引起脂质过氧化和DNA损伤（陈凤鸣等，2019）。还有研究发现，OTA可促进诱导型一氧化氮合酶的表达，增加一氧化氮的合成和亚硝酸盐/硝酸盐浓度（Sorrenti等，2013），而高浓度的一氧化氮会与O2.-发生反应，形成过氧亚硝酸盐，产生二氧化氮和OH-，从而导致氧化损伤。

3.1.3 OTA通过调控基因导致肝氧化损伤

在近几年的研究中，发现Nrf2（Nuclear factor erythroid 2 like 2）可维持线粒体氧化还原代谢功能，其不仅可以调节抗氧化和解毒反应，还可以调节生物能量功能和线粒体的合成（孙雪桐，2019）。Marin-Kuan等（2006）研究发现，在长期慢性致癌剂量OTA喂食的大鼠体内Nrf2表达降低。Cavin（2007）试验发现，OTA不仅可以降低Nrf2活性，还会抑制Nrf2调控基因的表达，造成碱基位点损伤从而导致氧化损伤。有趣的是，预处理Nrf2诱导因子可以阻止所有OTA介导的效应。Kensler等（2007）研究表明，抑制Nrf2及相关基因表达，会导致细胞对各种外来物质和氧化应激反应的防御能力下降。Cavin等（2009）研究也证实了Nrf2激活剂可以通过对抗OTA诱导的脂质过氧化来对抗氧化应激。综上，OTA可能通过降低肝脏线粒体内Nrf2基因的表达，来导致肝细胞氧化损伤。

此外，Marin-Kuan等（2006）通过基因表达谱分析发现，OTA可显著抑制肝细胞核因4α(HNF4α)调节基因的表达，并降低HNF4α活性，同时，OTA还抑制了由HNF4α调节基因编码的外源物代谢酶和具有运输OTA功能等多种功能的蛋白RNA和蛋白表达。可见，OTA也可降低HNF4α活性，抑制HNF4α调控的代谢酶RNA和蛋白质表达，从而导致肝细胞氧化损伤。

还有研究表明，OTA可能作为一种非基因毒性肿瘤启动子发挥肝毒性作用，可显著降低CX（Connexin）26、CX32和CX43基因的表达（Trosko，1998）。一些研究证实，CX32的表达对肝癌的发生有抑制作用，CX32 cDNA的转录抑制了肝癌细胞的生长（Evert等，2002）。此外，CX32启动子中转录因子与调控序列结合的修饰被认为是潜在的效应基础（Morsi等，2003）。因此，推测OTA可通过影响CX32的表达来诱导肝氧化损伤。

3.2 OTA引起肝氧化损伤的缓解机制

3.2.1 通过线粒体途径缓解肝氧化损伤

黄琳等（2008）研究发现，黄连解毒汤可以促进肝脏线粒体清除ROS等氧自由基，进而保护线粒体膜结构与功能的完整，以缓解OTA肝氧化损伤。王存福等（2011）研究表明，氨基胍可以降低肝脏线粒体CYP450 2E1活性，从而维持肝脏的氧平衡。张艳梅（2019）的相关试验显示，沙葱黄酮可抑制肝脏线粒体ROS的生成，改善肝脏线粒体ATP酶和呼吸链复合物Ⅱ活性，并提高其膜电位，从而维持肝脏线粒体的正常功能。

此外，还有研究指出，荔枝果肉多酚可提高线粒体内ATP酶、线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅱ活性及线粒体膜电位的水平改善肝脏氧化应激状态（张粹兰，2011）。柚皮素可保护H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的线粒体活性，改善SH-SY5Y细胞内线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ和SDH的活性及ATP的合成（Oliveira等，2017），从而缓解肝脏氧化损伤。齐墩果酸也被证实可以通过提高线粒体抗氧化酶活性，减轻线粒体肿胀度，增加线粒体活力等途径，进而有效保护肝氧化损伤（刘江正，2012）。何国林等（2016）试验表明，溪黄草总二萜可降低肝脏线粒体mPTP（Mitochondroal Permeablity Transition Por）的开放程度，保护肝脏线粒体膜结构和功能的完整，改善线粒体能量代谢，降低氧化损伤。因此，通过保护肝脏线粒体功能及膜完整性可缓解OTA引起的肝脏氧损伤。

3.2.2 通过还原酶途径缓解肝氧化损伤

OTA入侵机体后，会损害机体内在的抗氧化防御系统，造成氧化损伤。该系统中的SOD、CAT、GSH-Px和GSH等能够及时清除多余的自由基，使机体维持氧化与抗氧化的平衡。马永杰等（2009）通过比较试验发现，维生素E可提高机体SOD、GSH-Px的活性，从而维持机体内自由基的稳态平衡，以缓解OTA肝氧化损伤。赵士侠（2012）试验表明，低浓度的维生素C可提高细胞SOD活性，抑制OTA对细胞的毒性作用。黄钰（2014）研究发现，过表达硒蛋白S可降低细胞中MDA含量，并提高细胞中SOD和GSH水平，在一定程度内保护细胞拮抗OTA介导的氧化损伤。田静（2015）研究表明，L-精氨酸等护肝药物可使OTA感染的肝细胞内SOD活性和GSH含量显著回升，以减轻OTA对肝脏造成的氧化损伤。因此，通过提高抗氧化防御系统的酶活性和抗氧化物的含量，可以缓解OTA介导的肝脏氧化应激。

另外，陈平（2010）研究表明，Se可提高Nrf2的活性，并促进其下游谷胱甘肽硫转移酶A2、谷胱甘肽硫转移酶O1，以及TrxR1、GR、GCLC、GCLM等抗氧化相关基因的表达，提高细胞的抗氧化能力，减轻OTA引起的氧化损伤。于敏丽等（2017）探究发现，硒代蛋氨酸、亚硒酸钠通过上调GPx-1、GPx-4、Trx R水平，有效降低OTA所致的氧化损伤，提高氧自由基清除力，并通过下调凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12的表达，从而发挥抗细胞凋亡作用，在一定程度上缓解OTA所致损伤的进程。Xie等（2017）报道，姜黄素可通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路增加大鼠CAT mRNA的表达，对OTA诱导的氧化损伤起保护作用。Qi等（2018）研究表明，可以通过抑制Caspase 3和CDK1的表达来减轻OTA诱导的细胞损伤。综上，我们认为可以通过调节抗氧化酶活性，来维持机体的氧化稳态，进而起到缓解OTA对肝脏氧化应激损伤的作用。

4 结语

OTA可引起机体氧平衡失衡，并影响相关基因的表达和酶的活性，造成线粒体功能破坏，进而导致肝脏线粒体氧化损伤，甚至细胞凋亡。OTA分布广泛，在自然条件下不易降解消除，对生物机体有着严重危害。对于畜禽养殖业，更是危害巨大。畜禽食用含有OTA的日粮不仅会引起畜禽产生氧化应激，导致经济损失，还会在体内积聚，最终影响到人类的健康。随着研究的进一步深入，不少学者发现，调节机体抗氧化系统相关酶的活性和保护肝脏线粒体结构及功能的完整性能够缓解肝脏氧化损伤，而这也是目前保护肝氧化损伤的主要途径。围绕着这两大缓解途径，人医、兽医、饲料营养等方向的学者展开了大量研究，从中药提取物、化学提取物中发现了许多能减轻OTA引起的肝脏线粒体氧化损伤的物质，这也从另一个方面证实了OTA肝氧化损伤的缓解机制。尽管如此，关于OTA诱导肝脏线粒体损伤及氧化应激的作用与缓解机制还需要继续深入研究，OTA氧化损伤所造成的巨大经济影响也值得我们进一步探讨。