胞葬逃逸在动脉粥样硬化中的研究进展*

叶子明， 刘莹， 秦超△

广西医科大学第一附属医院 1神经内科， 2康复医学科(广西南宁 530021)

最新研究表明，脑卒中是我国居民致死、致残的首位原因，具有高发病率、高致残率、高病死率、高复发率、高经济负担五大特点[1-2]。全球≥25岁人群的卒中终生发病风险约为25%，而我国的脑卒中终生发病风险居世界第1位(39.3%)，其中以动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)为基础的超过70%，我国脑血管病防治面临巨大挑战[3-4]。不稳定AS易损性斑块的破裂及其所致的动脉-动脉栓塞是急性缺血性卒中事件发生的最主要机制[5]。坏死核心不断扩大是斑块不稳定性的重要原因，研究发现，有缺陷的胞葬作用，是斑块进展的关键因素，即斑块内坏死核心扩大不是因为死亡细胞过多，而是死亡细胞清除太少[6]。AS斑块中的胞葬效率只相当于身体其他部位的1/20[6]。本研究就胞葬、胞葬逃逸在AS斑块的发生、发展过程的作用进行综述。

1 何为胞葬、胞葬逃逸？

衰老、凋亡细胞的识别和清除是人体重要的生理功能之一。健康的人体每天可清除数十亿个衰老、凋亡细胞，机体在清除过程中会产生新的细胞以替代衰老、凋亡的细胞，以维持机体组织器官的稳态[7]。该过程是进化保守的细胞清除机制，被称为程序性细胞清除(programmed cell removal，PrCR)或胞葬作用(efferocytosis)。在生物学上指吞噬细胞将衰老、受损或死亡的细胞吞噬、降解，防止继发坏死、炎症[8]。在AS斑块中，细胞死亡一直存在于AS的整个过程，引起死亡细胞、坏死碎片的积聚，从而形成促进AS斑块进展、不稳定[9]。当斑块内被清除的凋亡细胞少于死亡细胞时，斑块进展、脂质核心扩大、不稳定。因此，促进斑块内凋亡细胞的清除，是抗AS的一个重要思路。

胞葬作用可分为几个不同的阶段[10]：(1)通过“找到我”(find-me)信号感知凋亡细胞。(2)识别阶段。通过“吃我”(eat-me)信号[如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)]及其桥接受体或调理素受体(如Mer酪氨酸蛋白激酶受体)以识别凋亡细胞。另外，它们之间可通过“别吃我”(don′t eat-me)信号相互作用，这些是活细胞抵抗被吞噬的信号，如整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)或CD47(cluster of differentiation 47)等。(3)吞噬阶段。包括调节吞噬的细胞骨架重排的分子和信号途径，如toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)、脂多糖受体(CD14)及钙(Ca2+)信号等。(4)消化和降解。包括分泌抗炎细胞因子(如白细胞介素-10)、转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)等进行清理凋亡细胞。

根据上述参与胞葬作用的过程，很显然，该过程必须完全协调，才能成功鉴别凋亡细胞和正常功能的健康细胞，并对凋亡细胞进行清除。上述步骤中只要一个步骤有缺陷就会导致斑块内死亡细胞聚集，斑块坏死核心不断扩大、进展，我们形象地称之为“胞葬逃逸”(efferocytosis escape)。总之，特定的“吃我”和“别吃我”分子之间的平衡决定了细胞命运。此外，我们不能忽视影响凋亡细胞配体识别和连接作用的分子，如MerTK的可溶性形式等。

2 AS中的“找到我”信号与胞葬逃逸

在AS斑块中，凋亡细胞的有效清除需要各种“找到我”信号的释放，从而导致吞噬细胞对斑块内凋亡细胞具有趋化作用。化学介质与“找到我”配体一起将吞噬细胞吸引到细胞死亡的区域。这些配体的主要类型包括血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)、核苷酸ATP和UTP、趋化因子CX3C配体-1(chemokine CX3 Cligand 1，CX3CL1)、裂解人酪氨酸-tRNA合成酶、溶血磷脂酰胆碱和鞘氨醇-1-磷(sphingosine-1-phosphate，S1P)等[11]。由于吞噬细胞可以通过这些信号识别凋亡细胞，对AS斑块的发展具有重要作用。由caspase-3激活的LPC信号是凋亡细胞发出的第一个“找到我”信号，LPC信号的缺失导致凋亡细胞清除的障碍，即胞葬逃逸，会导致慢性炎症和自身免疫性疾病的发生[12]。因此，“找到我”信号对凋亡细胞的胞葬作用和识别是必不可少的。

警报素(alarmins)，也被称为内源性危险信号或损伤相关分子(DAMPs)，是免疫系统对组织损伤反应的关键参与者。在许多炎症和自身免疫性疾病中，警报素被释放到细胞外环境，并与特定受体结合，刺激和促进先天免疫细胞的活化、细胞分化等[13]。警报素在稳态条件下存在于不同的亚细胞部位，如细胞质[如galectin-3(Gal-3)、热休克蛋白(HSPs)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、膜联蛋白、S100P]，细胞基质(如Gal-3、透明质酸、纤连蛋白)和细胞核(如核仁蛋白、HMGB1、Gal-3)[14-15]。内源性或外源性警报素可以增加胞葬作用，减少胞葬逃逸，从而延缓AS的进展[16]。因此，在AS斑块的发生、发展过程中，如何促进凋亡细胞“找到我”信号和警报素的表达，值得深入研究。

3 AS中的“吃我”信号与胞葬逃逸

凋亡细胞表面的“吃我”信号配体与吞噬细胞的吞噬受体相互作用并活化它们，导致胞葬作用的启动[17]。尽管“找到我”信号可以使吞噬细胞接近凋亡细胞，但相邻细胞中凋亡细胞的特异性识别取决于ACs暴露的“吃我”信号，通过吞噬作用选择性清除凋亡、受损细胞。“吃我”信号是识别凋亡细胞，并通过吞噬细胞启动吞噬作用的关键因素。“吃我”信号表达的任何缺陷都导致胞葬逃逸，并与AS进展密切相关[18]。“吃我”信号是胞葬作用中最关键的分子，这些信号的损伤对细胞吞噬作用有重要影响，可以导致AS进展。因此，针对“吃我”信号的靶向治疗，比靶向胞葬其他相关分子的治疗更有效。

与“吃我”信号有关的一个关键分子是TAM受体(Tyro3、Axl和Mer),属于受体酪氨酸激酶家族，并且在细胞增殖、存活、黏附、迁移、凝血和炎症中具有重要作用。TAM受体在桥接分子生长停滞特异性基因6(growth arrest-specific gene 6 product，Gas6)、蛋白S等在作用下，可被维生素K依赖性蛋白激活[19]。Gas6和蛋白S通过重组凋亡细胞上的PtdSer和吞噬细胞上的MerTK促进凋亡细胞的清除[20]。此外，与“吃我”信号相关，影响巨噬细胞吞噬能力的关键因素是桥接分子，如C1q补体(作为调理分子)、吞噬细胞受体、TG2和其他“吃我”配体等[21]。C1q增加巨噬细胞的吞噬和泡沫细胞的胞葬作用。C1q促进巨噬细胞在过量摄取胆固醇期间的存活并改善巨噬泡沫细胞的功能。因此，C1q可能是延缓疾病进展的重要因素，并且可能在早期AS期间具有保护作用[22]。作为丝裂原活化蛋白激酶家族及G蛋白偶联受体成员的细胞周期信号调节激酶5(extracellular-signal-regulated kinase 5，ERK5)可以调节与胞葬作用相关的分子，并且是参与胞葬作用分子的主要调节分子。巨噬细胞特异性ERK5缺失的小鼠，表现为参与胞葬作用的桥接分子和巨噬细胞受体的表达减少，结果增加了AS病变的斑块、坏死核心的大小及不稳定[23]。因此，与“吃我”信号相关的桥接分子表达异常，同样导致胞葬逃逸，在AS斑块的发生、发展过程中起重要作用。

4 AS中的“别吃我”信号与胞葬逃逸

胞葬过程如何鉴别凋亡细胞与正常活细胞？凋亡细胞表面表达一组配体，有时称为凋亡细胞相关分子(apoptotic-cell-associated molecular patterns，ACAMP)，以确保其快速被摄取和清除。凋亡细胞表面上的“找到我”信号如ACAMP、钙网蛋白(calreticulin，Calr)、PtdSer等，其通常局限于细胞内膜并在细胞凋亡期间外化。与“吃我”信号相对应，活细胞通过表面“别吃我”信号抑制吞噬细胞的吞噬作用[24]。CD61、CD31、CD46和CD47的高表达保护健康细胞免于被吞噬[25]。CD47作为“自身”的标记，即作为“别吃我”的信号，与另一种细胞表面糖蛋白α(regulatory protein α，SIRPα)结合，使其胞葬逃逸得以实现，SIRPα是吞噬细胞表面上的吞噬作用抑制性的受体。正常生理情况下，CD47在细胞凋亡过程中通过细胞应激迅速降低，导致正常组织中凋亡细胞的胞葬作用增强增多。然而在AS斑块中，凋亡细胞的CD47表达没有降低，因此导致凋亡细胞胞葬逃逸[24]。在AS的小鼠模型中，抗CD47分子抗体的使用可有抗AS作用，可阻止斑块发展，防止斑块破裂和减小斑块坏死核心的面积[24]。但抗CD47抗体治疗AS导致脾脏肿大、红细胞被异常吞噬和代偿性网状红细胞增多等不良反应，目前还不能在临床应用。我们课题组研究发现，长链非编码RNA MIAT通过miR-149-5p上调CD47导致凋亡细胞胞葬逃逸，从而导致AS斑块不稳定[26]。为靶向下调斑块内凋亡细胞CD47的表达，从而稳定斑块、延缓斑块进展提供了新的思路和靶点。

导致胞葬逃逸的最重要的基因是9p21基因，而且已发现该基因的突变与AS有关[27]。这种遗传风险与传统的ACVD风险因素如高血压、高脂血症、糖尿病和吸烟等不同，这些传统因素也与胞葬逃逸有关[27]。缺乏Cdkn2b基因也被证实促进AS斑块的发展，并使斑块更大，更加不稳定[20]。通过易感基因研究，使临床医师可以从遗传学角度筛查AS高危人群，早期预防疾病发生，针对不同患者的个体化治疗。

5 AS中Mer酪氨酸激酶(MerTK)与胞葬逃逸

MerTK表达在吞噬细胞的表面，并在Gas-6作为桥连分子的帮助下介导凋亡细胞的吞噬。在人类AS斑块中，MerTK位于巨噬细胞表面，但不存平滑肌细胞表面。MerTK缺乏导致AS斑块中的胞葬逃逸，坏死核心增大[28]。在MerTK-/-/LDLR-/-动物中抑制MerTK引起坏死核心的进展，凋亡细胞的累积和更多的炎性细胞因子[29]。研究表明在MerTK-/-ApoE-/-小鼠中凋亡细胞的数目和坏死斑块的面积增加，而Ldlr-/-/MerTk-/-小鼠斑块中胞葬作用减少[30-31]。因此，在AS斑块的进展过程中，促进巨噬细胞MerTK的表达，有助于稳定斑块。

6 AS中可溶性受体与胞葬逃逸

可溶性“吃我”配体，例如Mer和CD36，在胞葬作用和斑块形成中起重要作用。金属蛋白酶17(metalloproteinase 17，ADAM17)引起MerTK可溶性形式的释放[32]。在ADAM17敲除的小鼠中，ADAM17产生的可溶性形式的CD36，导致胞葬逃逸。吞噬受体的脱落不仅与凋亡细胞的吞噬作用减少有关，而且还作为竞争性抑制剂起作用，其可阻碍相邻细胞中潜在的胞葬作用，导致胞葬逃逸。Thbs-1充当桥接分子(调理素)以连接凋亡细胞表面上的PtdSer和吞噬细胞上的CD36，导致胞葬作用的增加。此外，AnxA5以高亲和力与PtdSer结合，并通过PtdSer的解离来抑制凋亡细胞的胞葬作用。因此，ADAM17的拮抗剂可以减少Mer和CD36的抑制性影响，导致ACVD中胞葬作用增加。此外，研究表明，缺氧抑制胞葬作用的CD36受体和MerTK的表达，导致胞葬逃逸，促进AS的进展[33]。因此，改善斑块的缺氧状况可以促进胞葬作用并减缓AS的进展。

7 AS中乳脂肪球-表皮生长因子8与胞葬逃逸

乳脂肪球-表皮生长因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8，MFG-E8)是一种抗炎因子，它的血清浓度与2型糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的并发症呈负相关[34]。在富集凋亡细胞的早期AS斑块中，人血管组织中的MFG-E8表达水平降低。MFG-E8是一种重要的桥接分子，它与吞噬细胞表面的整联蛋白分子如整合素β3结合，充当黏附和转导分子，并参与一些重要的功能，如锚定、迁移、存活、增殖、细胞生长和分化，以及巨噬细胞重编程。研究指出，MFG-E8的血清水平与冠状动脉狭窄的严重程度和临床事件的风险呈负相关[35]。因此，巨噬细胞产生的MFG-E8对于改善胞葬作用和预防炎症是必要的。MFG-E8促进胞葬作用可能与参与胆固醇逆转运的转谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TG2)直接相关。这种机制可能归因于ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)表达的增加和TG2引起的ABCA1介导的胆固醇的逆向转运，其增强ABCA1介导的凋亡细胞的摄取和随后体外胞葬作用的增加[17]。因此，在AS斑块的进展过程中，促进巨噬细胞MFG-E8的表达，可促进斑块内凋亡细胞的清除，减小坏死核心。

8 展望

胞葬作用在动脉粥样硬化性疾病中具有巨大的应用前景。众多的信号分子参与了胞葬作用，包括“发现我”、“吃我”和“不吃我”信号、桥接分子、可溶性受体、调节因子等。“不吃我”和“吃我”信号之间的平衡，决定了发出这些信号的细胞的命运，也决定了胞葬作用的效率。人体利用这些信号来确定哪些细胞需要清除，哪些细胞不需要清除。除了“吃我”、“不吃我”信号分子外，桥接分子在调节胞葬过程中也起着重要作用。不同的机制可以降低细胞的胞葬能力，导致胞葬逃逸，包括直接损失(比如吞噬细胞自身的凋亡)、吞噬能力较低的吞噬细胞增多(包括M1巨噬细胞、SMCs和泡沫细胞)、AS斑块内的坏死核心周围成熟DC增加。胞葬逃逸导致AS进展，特别是在基因易感人群中，如携带9p21基因变异的人群。

总之，本综述讨论了在AS斑块形成过程中清除凋亡细胞的重要性。胞葬作用的过程非常复杂，涉及的各种因素、信号途径，在设计新的治疗方法以降低AS、避免其临床并发症时，这些都是需要考虑的靶点和因素。