RNA腺嘌呤6-甲基化修饰调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的研究进展

刘俊圻 陈艺尹 杨文宾

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院口腔颌面外科 成都 610041

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell）是主要存在于骨髓的一类具有自我更新及多向分化为骨相关结构潜能的干细胞[1]。在生理状态下，作为成骨细胞和骨髓脂肪细胞的共同祖细胞，骨髓间充质干细胞成骨向分化与成脂向分化的相互平衡受到严格的时空控制，以保障骨骼健康。在衰老或激素紊乱等病理刺激下，骨髓间充质干细胞优先向脂肪细胞分化，导致骨髓脂肪组织沉积以及进行性骨质丢失。年龄相关的骨质疏松症的特点即是骨量减少，骨髓中脂肪组织过度沉积。骨微结构的改变增大了骨折的风险，为患者的日常活动带来不便。

作为成骨细胞的最主要来源，骨髓间充质干细胞一直被视作解决骨相关疾病的一个跳板[2-3]。然而，由于骨髓间充质干细胞在分化为成骨细胞的同时，也能分化为软骨细胞、脂肪细胞等其他结构，给其临床应用带来不确定性，故研究骨髓间充质干细胞成骨向分化的明确机制显得尤为重要。在过往的研究中，研究者多把重心放在了一些外在的影响因素以及转录因子上，随着表观遗传学研究的不断发展，学界对于骨髓间充质干细胞命运决定机制的理解及研究得以进展。

表观遗传是指不改变基因本身的核苷酸序列，但基因的表达却发生了可遗传性改变的一种遗传方式，通常包括DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA（Micro RNA，miRNA）以及RNA甲基化等。其中，DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA等已被公认为参与调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的重要表观遗传学标记，但关于RNA腺嘌呤6-甲基化修饰在骨髓间充质干细胞成骨向分化中扮演的角色却鲜少被提及[4-6]。新近的一系列研究则逐渐填补了这一空白，提示RNA腺嘌呤6-甲基化修饰调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的作用不容小觑。

1 RNA腺嘌呤6-甲基化修饰介绍

RNA腺嘌呤6-甲基化修饰是指RNA腺嘌呤的6号位N原子被甲基化，形成6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A），是真核生物RNA上丰度最高的表观遗传学修饰。比如平均每个mRNA上就有3~5个m6A位点[7-8]。

1.1 RNA腺嘌呤6-甲基化修饰的调节因素

RNA腺嘌呤6-甲基化修饰是动态可逆的，其功能的发挥依赖于甲基转移酶、去甲基化酶以及读取蛋白三者的共同调节[9]。

甲基转移酶负责催化m6A的形成。在哺乳动物中，甲基转移酶主要包括甲基转移酶样（methyltransferase like，METTL）3、METTL14、肾母细胞瘤1相关蛋白（Wilms tumour 1-associated protein，WTAP）以及KIAA1429。METTL3与METTL14通过形成异源二聚体发挥甲基转移酶的催化作用，其中METTL13是催化亚基，而METTL14则是促进RNA结合的必要成分[10-13]。WTAP虽无直接的甲基转移酶活性，但对于引导METTL3-METTL14复合体至核散斑起着至关重要的作用[14-15]。

去甲基化酶FTO和ALKBH5则可“擦除”这种甲基化修饰。FTO和ALKBH5虽然在酶动力学上表现相当，但在组织分布以及具体的功能上却表现出一定的特异性。FTO在大脑以及脂肪组织中表达水平最高，并参与中枢神经系统以及脂肪形成的调控[16-20]。ALKBH5则在睾丸中分布最多，并与精子的正常形成息息相关，Alk-bh5基因缺陷会导致雄性小鼠不育[20]。

m6A通过改变RNA结构或者吸引特定的RNA读取蛋白从而影响RNA的代谢[21]。常见的读取蛋白主要包括含YTH结构域的蛋白质以及真核生物起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）3。对哺乳动物来说，含YTH结构域的蛋白质主要包括YTHDC1-2和YTHDF1-3[22]。YTH结构域可折叠成疏水的袋状结构，从而直接容纳并且紧密结合RNA m6A残基，介导下游RNA的翻译、降解以及选择性剪切等过程[23-25]。哺乳动物和酵母中的m6A大多位于mRNA终止密码子附近和3"端非翻译区[26-28]，eIF3则可以直接或者在YTHDF1的诱导下间接与mRNA 5"端非翻译区的m6A结合，而影响mRNA的翻译效率[29]。值得注意的是，随着表观遗传学的高速发展，不断有新的酶或蛋白质被发现可能成为上述三类物质的新成员，丰富了学界对RNA腺嘌呤6-甲基化修饰的理解与认识[9,29-30]。

1.2 RNA腺嘌呤6-甲基化修饰对干细胞分化的调控

RNA m6A位点或水平的变化可能导致在个体正常生长、发育过程中负责干细胞分化的关键基因表达增强或受阻，从而调控干细胞的分化。过往的一系列研究[31-34]表明，RNA m6A在胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞等干细胞的分化过程中都发挥了十分重要的作用。

Geula等[35]发现胚胎干细胞的原始态和始发态受到RNA m6A的调控，认为m6A可降低mRNA的稳定性，抑制m6A会使优势基因表达更加明显。故敲除原始态胚胎干细胞内Mettl3之后，原始态胚胎干细胞将倾向于维持幼稚状态，更难进入始发态，分化受到了抑制。同理，敲除始发态胚胎干细胞内Mettl3会抑制其自我更新，而促进其不断分化[35-36]。

Zhang等[37]发现，RNA m6A通过YTHDF2介导notch1a mRNA和rhocamRNA的稳定性，参与调控造血内皮细胞的内皮基因和造血基因表达平衡，从而影响造血干细胞的生成。Mettl3的缺失将导致动脉内皮发育相关的mRNA的丰度增加，内皮-造血转化过程受到阻断。此外，Weng等[38]在研究中还发现，METTL14通过m6A抑制造血干细胞和部分急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞分化，抑制METTL14则会促进上述细胞的终末髓系分化并抑制AML细胞的增殖，揭示了m6A在急性髓系白血病的发病机制中的重要作用。

在神经干细胞中，m6A多在与转录因子、神经发育、细胞周期和神经元分化有关的mRNA上富集。Yoon等[39]发现无论敲除胚胎小鼠大脑中的Mettl3还是Mettl14，均会降低大脑内m6A水平并延长放射状胶质细胞的细胞周期。Li等[40]发现FTO缺乏会抑制小鼠体内成年神经干细胞的增殖和分化，可能是由于m6A标记的脑源性神经营养因子通路的几个关键因子的表达发生改变。Wang等[41]敲除小鼠胚胎神经干细胞内Mettl14后，神经干细胞增殖受到抑制以及分化提前，即m6A可促进胚胎神经干细胞的增殖并预防其过早分化，从而保障神经干细胞的储备。值得一提的是，该团队还首次提出m6A可通过影响组蛋白H3赖氨酸27乙酰化、组蛋白H3赖氨酸27三甲基化、组蛋白H3赖氨酸4三甲基化在内的部分组蛋白修饰而调节基因的表达。Chen等[42]发现，敲除成年神经干细胞内的Mettl3，会抑制其增殖并导致其更倾向于分化为胶质状细胞。同时，敲除Mettl3减少了组蛋白甲基转移酶Zeste基因增强子同源物（enhancer of Zeste homolog，Ezh）2和赖氨酸27三甲基化组蛋白H3的表达，而Ezh2的过表达可以恢复神经干细胞的正常增殖与分化，再次揭示m6A与组蛋白修饰在调控神经干细胞增殖、分化方面存在着紧密联系。

此外，m6A mRNA修饰与胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cell）的自我更新和肿瘤发生紧密相关。抑制METTL3或METTL14可显著促进人胶质母细胞瘤干细胞的生长、自我更新与肿瘤发生；相反，METTL3的过表达或FTO的抑制则会抑制胶质母细胞瘤干细胞的生长和自我更新。同时，将缺乏FTO的胶质母细胞瘤干细胞移植到小鼠体内，能减慢肿瘤进展并延长小鼠寿命，为治疗胶质母细胞瘤提供了一个潜在的靶点[32]。

2 RNA m6A调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的机制

关于RNA腺嘌呤6-甲基化修饰在骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中发挥的作用，目前的研究主要局限于甲基转移酶METTL3以及去甲基化酶FTO。总体来说，在骨髓间充质干细胞内，METTL3可促进其成骨向分化，而FTO的表达上调则会抑制其成骨向分化，促进其成脂向分化。其他与RNA m6A形成相关的因素在此过程中发挥的作用仍有待进一步研究。

2.1 甲基转移酶METTL3

METTL3广泛存在于小鼠骨细胞以及骨髓中，然而极少见于生长板的软骨区域[43]。体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化的过程伴随着Mettl3在mRNA和蛋白质水平表达的增加，提示m6A可能与骨髓间充质干细胞谱系分化密切相关[44]。条件性敲除小鼠骨髓间充质干细胞内Mettl3基因（Prx1-Cre;Mettl3fl/fl）后，骨髓间充质干细胞内m6A的丰度降低，小鼠出现了骨质疏松的病理表型（骨量减少，骨质变弱以及骨髓脂肪组织沉积增加）。同时，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠体内破骨细胞状态更为活跃。与前述发现相符的是，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠生长板的生长发育几乎不受影响[43]。

体外细胞学实验解释了这种现象：相比于对照组小鼠，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化受到抑制，成脂向分化则更加活跃。同样的现象也出现在Lepr-Cre;Mettl3fl/fl小鼠身上，表明Mettl3对成体骨髓间充质干细胞的成骨向分化同样不可或缺。RNA测序结果进一步证实，Mettl3参与调控骨髓间充质干细胞的谱系分化：Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠体内Dlx5、Sp7、Alpl、Bglap等成骨相关基因表达受到抑制，而成脂相关基因Pparg、Plin1、Fabp4的表达上调[43]。

Mettl3的过表达能在一定程度上缓解雌激素缺乏引起的骨质疏松。在绝经后骨质疏松模型小鼠的骨髓间充质干细胞内敲入Mettl3基因（Prx1-Cre;Mettl3KI/KI），相比于仅行卵巢切除术的对照组来说，成骨细胞数目增加，骨小梁密度和骨量的减少与骨髓脂肪组织沉积的程度均有所降低。值得注意的是，不同于敲除Mettl3基因，敲入Mettl3基因并未影响破骨细胞的活性[43]。

上述实验结果提示，METTL3介导的m6A水平上升促进骨髓间充质干细胞成骨向分化，抑制了其成脂向分化。对于具体的分子机制，不同研究者得出了不同的结论。

Wu等[43]认为，甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）/甲状旁腺素1受体（parathyroid hormone-1 receptor，PTH1R）信号轴是m6A调控骨髓间充质干细胞分化的重要下游通路。分析发现，在PTH1R翻译终止密码子附近有高富集和特异性的m6A峰，敲除Mettl3不影响Pth1r的转录，但大大降低了PTH1R的翻译效率。PTH1R作为PTH的受体，对于PTH调节骨代谢必不可少[45-46]。在正常生理状态下，小剂量间歇性的PTH可促进骨髓间充质干细胞成骨向分化，并抑制其成脂向分化[47-48]。不同于对照组，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠对小剂量间歇性的PTH并不敏感，但这种情况可通过腺病毒介导的PTH1R过表达有所缓解，进一步证实了m6A可通过影响PTH/PTH1R信号通路调控骨髓间充质干细胞的分化方向。值得注意的是，过表达PTH1R只能部分缓解症状，提示甲基转移酶METTL3除了Pth1r外，还可能存在其他的作用靶点[43]。

Tian等[44]认为，m6A可通过调控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein-kinase B，PKB/AKT）参与骨髓间充质干细胞的成骨向分化。PI3K-AKT通路作为细胞内十分常见的信号通路，已被广泛证实对于调控骨髓间充质干细胞谱系分化、维持骨代谢平衡具有重要意义[49-52]。在利用短发夹RNA（shorthairpin RNA，shRNA）下调骨髓间充质干细胞内Mettl3表达后，骨髓间充质干细胞成骨向分化以及矿化潜能受到抑制。利用Kyoto基因与基因组数据库分析在此过程中下调的细胞通路，结果显示与成骨分化最为相关的为PI3K-AKT通路。蛋白质印迹实验显示，敲除Mettl3之后，AKT的磷酸化程度降低，与RNA测序结果一致，进一步证实PI3KAKT信号轴是Mettl3调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的重要下游通路。

此外，METTL3可通过选择性剪接血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA，影响VEGF的表达，从而参与调控骨髓间充质干细胞成骨向分化。VEGF作为血管生成最有效的诱导因子之一，通过促进局部微循环和增加血管密度促进骨组织发育[53-54]。早前研究[55]发现，Vegfa-164 mRNA和Vegfa-188 mRNA参与调控间充质干细胞的增殖、分化。敲除Mettl3可显著降低Vegfa-164 mRNA和Vegfa-188 mRNA的水平，为m6A选择性剪接Vegfa mRNA从而参与骨髓间充质干细胞成骨向分化提供新的证据。

Yao等[52]发现，METTL3通过催化Janus激酶（Janus kinase，JAK）1的mRNA形成m6A，随后读取蛋白YTHDF2通过识别m6A促进JAK1降解，下调JAK1/信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）5/CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein，C/EBP）β信号通路的表达，从而抑制脂肪形成早期骨髓间充质干细胞的成脂向分化。遗憾的是，该通路对于骨髓间充质干细胞成骨向分化的具体作用还有待进一步研究。

2.2 甲基化酶FTO

早期研究[18]发现，FTO通过调控m6A丰度选择性剪接成脂调控因子Runt相关转录因子（Runtrelated transcription factor）1的mRNA，从而在调节脂肪生成中发挥重要作用。研究者[56]通过分析人与小鼠的血清样本发现，相比于年轻和正常组，年长和骨质疏松组的血清中FTO含量更高，m6A的含量更低；同时，在体外诱导骨髓间充质干细胞成脂向分化的过程中，FTO的含量增加，而成骨向分化的过程则伴随着FTO含量的减少，为探究FTO对于骨髓间充质干细胞成骨向分化的具体影响提供了线索。

Shen等[56]研究发现，生长发育因子（growth differentiation factor，GDF）11-FTO-过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）γ信号轴可以促进骨髓间充质细胞的成脂向分化，抑制其成骨向分化。GDF11是属于TGF-β超家族的一种蛋白质，早前的研究[57]表明其能促进骨吸收并抑制成骨细胞分化。体外实验发现，GDF11可通过C/EBPα促进小鼠骨髓间充质干细胞内FTO的表达，降低RNA m6A的丰度，并且FTO与RNA m6A变化的程度与GDF11的使用剂量呈正比。同时，GDF11促进骨髓间充质干细胞成脂向分化、抑制其成骨向分化作用的正常发挥有赖于FTO的正常酶活性。之前的研究[19,58]已证明，PPARγ可以促进骨髓间充质干细胞的成脂向分化而抑制其成骨向分化，同时作为FTO的下游分子介导脂肪前体细胞的分化。Shen等发现， PPARγ可作为GDF11-FTO通路的下游分子，对于GDF11与FTO调控骨髓间充质干细胞分化方向不可或缺。GDF11-FTO通过结合并去甲基化修饰PpargmRNA，影响PpargmRNA的翻译效率，导致后者的表达增加，从而抑制了骨髓间充质干细胞的成骨向分化。此外，体内实验表明，特异性敲除小鼠成骨细胞内Fto可以抑制PPARγ、脂联素（adiponectin）的表达，促进Osterix的表达，并在一定程度上缓解了小鼠的骨量减少的症状。

3 展望

随着近年来表观遗传领域的不断发展，表观遗传学修饰调控干细胞分化的具体机制也逐渐成为学界关注的热点。近来的一些研究发现，m6A在骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中发挥了重要的作用，为研究m6A在骨骼健康和疾病中的关键调控作用提供了一个新的视角。然而，目前的研究还不足以对m6A调控骨髓间充质干细胞命运决定的具体机制进行较为清楚的阐释。一方面，m6A在骨髓间充质干细胞内的具体位点还不够清楚；另一方面，甲基转移酶、去甲基化修饰酶以及m6A读取蛋白三者在骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中发挥的具体作用也有待进一步研究。同时，随着研究的深入以及相关检测技术的进步，比如miCLIP技术的出现，意味着可以定位细胞内mRNA的单个m6A位点 ，有理由相信RNA腺嘌呤6-甲基化修饰调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的具体机制将得到更为深入的阐释，为相关的基础研究以及临床应用带来重要的启发。