桑枝多糖通过调节肠道菌群降血糖的作用研究

(右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心，广西 百色 533000)

糖尿病是一种慢性糖代谢障碍的疾病，以高血糖为特征，分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，其中Ⅱ型较为常见，发病机制主要为自身免疫破坏的胰岛功能敏感性不足或缺陷导致的胰岛素抵抗[1-2]。以胰岛素不足为特征的胰腺功能低下，糖尿病患者可能会随着时间的推移遭受威胁生命的合并症。可见，纠正高血糖或低胰岛素血症是预防和治疗糖尿病的有效策略。目前，临床上用于糖尿病治疗的药物已经取得了一些成功，特别是口服降糖药二甲双胍(MF)等，但是糖尿病还是未能得到有效的控制，药物的依赖性、耐药性等问题逐渐凸显[3-4]。天然药物具有一定的降血糖作用，而且部分天然药具有恢复胰岛素功能，是控制高血糖的良好药物[5-6]。我们前期研究发现桑枝多糖具有较好的降血糖作用，但是其作用机制尚未完全清楚[7]，因此本文从桑枝多糖调节肠道菌群层面研究其降糖机制，具体如下：

1 材料与方法

1.1实验动物 雌性SPF级C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，共30只，购于南京医科大学实验动物中心，动物许可证号：生产许可(苏)2016-002。 适应性饲养1周后，开展实验。

1.2化学制品和试剂 链脲佐菌素STZ(Sigma，USA)、盐酸二甲双胍片(MF、北京京丰制药集团有限公司)、血糖测试条(罗氏活力型血糖仪配套)、粪便DNA提取试剂盒(天根)、Q-PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1桑枝多糖提取 按照课题组前面的提取方法[7]，主要步骤是石油醚脱脂，水煮，氯仿-正丁醇去除蛋白质，乙醇、乙醚、丙酮提取多糖，色谱系统纯化，GC-201系列色谱系统(日本岛津)检测桑枝多糖(RMP)纯度，纯度为85.2%。

1.3.2建立STZ糖尿病小鼠模型 适应性喂养7 d后，给小鼠腹膜内注射STZ缓冲溶液(150 mg/kg)。在72 h后从禁食处理过的小鼠中提取尾静脉血样品100 μl。小鼠的空腹血糖(FBG)值高于11.1 mmol / L为糖尿病造模成功小鼠。将STZ糖尿病小鼠分为不同的组：磷酸缓冲盐溶液(PBS)治疗对照组，RMP治疗组和MF治疗组，每组7只小鼠。PBS组小鼠灌胃PBS，RMP组小鼠灌胃RMP 600 mg/kg·d-1，MF组小鼠灌胃MF 600 mg/kg·d-1，正常对照组灌胃等量生理盐水，连续灌胃2周。

1.3.3标本采集 给药后2周，小鼠禁食12 h的断尾取血测定空腹血糖值，并采集小鼠粪便及回肠内容物检测肠道菌群。

1.3.4肠道内容物细菌总16SRNA检测 ①16SRNA提取按照试剂盒说明书进行(TIANGEN DP121221)；引物为：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。②实验方法和反应参照参考文献[8]，20 μl体系(SYBR 10 μl，Primer 0.4 μl，DNA 1 μl，ddH2O 8.2 μl)，第一步95℃，300 Sec，第二步95℃，10 Sec，60℃，30 Sec，40个循环。

1.3.5小鼠粪便肠道菌群检测 小鼠粪便肠道菌群检测送华大基因有限公司完成，基于物种注释结果和OTU进行样品组间物种差异分析及物种复杂度分析。

2 实验结果

2.1小鼠血糖 经造模后筛选空腹血糖值高于11.1 mmol / L归类为糖尿病小鼠，共筛选出21只糖尿病小鼠，把小鼠平均分为糖尿病造模小鼠非治疗组(PBS组)、桑枝多糖治疗组(RMP组)、二甲双胍治疗组(MF组)。经治疗后，正常组(Normal)、PBS组、RMP组、MF组的平均血糖分别为5.4 mmol/L、13.2 mmol/L、5.6 mmol/L、5.8 mmol/L ，RMP组和MF组血糖明显降低，与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 各组小鼠的血糖浓度比较

注：Normal：正常小鼠组；PBS：糖尿病造模小鼠PBS治疗组；RMP：桑枝多糖治疗组；MF：二甲双胍治疗组；**为P<0.01

2.2小鼠肠道菌群总16SRNA 对小鼠肠道粪便和回肠内容物检测发现，PBS组、RMP组、MF组相对正常组小组的16SRNA百分比分别为86.86%/80.00%、120.43%/125.11%、109.00%/112.86%；PBS组菌群总量减少，RMP组和MF组菌群总量增加，PBS组与正常组没有显著差异，但是RMP组和MF组与PBS组对比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 小鼠粪便和回肠内容物肠道菌群16SRNA量变化

注：Normal：正常小鼠组；PBS：糖尿病造模小鼠PBS治疗组；RMP：桑枝多糖治疗组；MF：二甲双胍治疗组；每组7只小鼠；*为P<0.05，**为P<0.01

2.3小鼠粪便肠道菌群变化 对小鼠粪便肠道菌群检测发现，糖尿病造模PBS治疗组在门水平中拟杆菌门、变形菌门明显升高，厚壁门明显降低(见图3A)；在科水平中肠杆菌科和类杆菌科明显升高，双歧杆菌科、肠球菌科、乳杆菌科、链球菌科明显降低(见图3B)；在属水平中志贺氏菌属、大肠杆菌属、变形杆菌属、克雷伯菌属明显升高，双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属明显降低(见图3C)。RMP组和MF组无明显差异，但相对PBS组，在属水平中志贺氏菌属、变形杆菌属、克雷伯菌属明显降低，双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属明显升高；而且RMP组和MF组菌群多样性程度更高(见图3D)。

图3 小鼠粪便肠道菌群变化

注：A.门水平；B.科水平；C.属水平；D.多样性变化；PBS：糖尿病造模小鼠PBS治疗组；RMP：桑枝多糖治疗组；MF：二甲双胍治疗组；每组7只小鼠

3 讨论

糖尿病是一种机体胰岛素分泌不足或利用缺陷而发生的一种慢性病，常见的是Ⅱ型糖尿病，主要影响因素包括种族、年龄、体重、肥胖、生活方式等[9-10]。近年研究发现肠道菌群与Ⅱ型糖尿病有密切相关，肠道菌群失调影响宿主能量代谢、炎症反应，调节肠道菌群可以改善糖代谢和胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性[11-12]。桑枝是民间常用中草药，《本草图经》记载：“桑枝疗遍体风痒干燥，兼疗口干”，现临床上主要用于治疗肩臂关节及手足酸痛麻木、风湿痹痛、瘫痪等多种疾病。我们的前期研究及其它课题组的研究也都发现桑枝的主要成分桑枝多糖具有降低血糖，提高胰岛素敏感性的作用，但是其机制尚未清楚[7，13-14]。部分植物多糖可以作为益生元对肠道菌群的组成结构进行调节，产生的代谢产物影响菌群之间的相互作用，再进一步影响宿主健康[15-16]，桑枝多糖是否也是通过对肠道菌群的调节发挥降糖作用尚未见报道。

本研究在糖尿病小鼠造模成功后分别用PBS、RMP和MF进行治疗，RMP和MF均能降低血糖，两者没有显著差异；检测肠道粪便及回肠内容物16SRNA总量和肠道菌群的变化，PBS治疗组16SRNA总量减少，在属水平中志贺氏菌属、大肠杆菌属、变形杆菌属、克雷伯菌属明显升高，双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属明显降低，在科和门水平中也有对应一致的变化；RMP组和MF组无明显差异，但相对PBS组，检测结果刚好相反，说明RMP组和MF组能通过降低志贺氏菌、大肠杆菌、变形杆菌、克雷伯菌，升高双歧杆菌、肠球菌、乳杆菌、链球菌、葡萄球菌，从而调节肠道菌群结构，达到降低血糖的作用。肠道菌群变化可能还涉及其它菌群，因本研究的小鼠数量较少，可能检测出来的并不够全面；另外本文涉及的肠道菌群代谢产物是否影响了血糖的变化尚需进一步的研究。