戴 双,郭 军,程敦公,曹新有,巨 伟,訾 妍,吉万全,宋健民
(1.山东省农业科学院作物研究所/小麦玉米国家工程实验室/农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室, 山东济南 250100;2.山东省农作物种质资源中心, 山东济南 250100;3.西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100)
叶片衰老不仅是一个细胞程序化死亡的过程,也是营养成分再利用的过程,如N元素由衰老叶片转移到新生叶片以及叶片中的养分向籽粒中的转移[1-3]。叶片衰老受激素调控,如脱落酸、乙烯和茉莉酸可促进叶片的衰老,而细胞分裂素(CTK)则直接参与衰老相关的过程[4],包括叶绿素的降解过程和光合作用相关酶的降解过程(如Rubisco酶的降解)。Simmonds等[5]研究表明,延缓小麦旗叶衰老可以提高作物产量。因此,延缓叶片衰老对于培育高产新品种具有重要意义。
PSAG12(promoter of senescence-associated genes)是从拟南芥中分离到的衰老特异性启动子,IPT(isopentenyl transferase gene)是从根瘤农杆菌中分离到的异戊烯转移酶基因,是CTK合成的限速酶[6]。1995年,研究人员首次将PSAG12和IPT构建到同一个表达载体上,并获得携带PSAG12-IPT的转基因烟草,结果发现,与非转基因烟草相比,携带表达载体PSAG12-IPT的转基因烟草叶片持绿时间更长,衰老速度变慢[6]。其作用原理为:当叶片开始衰老时,SAG12被特异激活,促进IPT基因表达,CTK含量增加,使叶片衰老延缓;而叶片衰老延缓反过来又使SAG12启动子关闭,从而避免CTK的过量合成造成植物形态和发育的异常。之后,研究人员将同时携带PSAG12和IPT的表达载体转化到其他植物中,如小麦、油菜、拟南芥、匍匐剪股颖、棉花、玉米、花生和多年生草,获得了一系列转基因株系,发现PSAG12和IPT的共表达载体与植物抗旱性、耐涝性、耐盐性、衰老速度、光合作用和氮素分配等密切相关[6-14]。然而关于PSAG12-IPT基因是否延缓普通小麦衰老的研究较少。
本研究利用共表达PSAG12和IPT的转基因小麦材料TIPT-XN1376与推广小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023进行杂交,获得F1,自交获得F2,并对其进行分子标记辅助选择和叶绿素含量测定,研究PSAG12-IPT基因在小麦中的遗传特点及其与衰老和叶片叶绿素含量的关系,以期为PSAG12-IPT基因在小麦育种中的利用奠定基础。
携带PSAG12和IPT表达载体的转基因小麦TIPT-XN1376(受体亲本为西农1376)由西北农林科技大学提供,推广小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023由山东省农业科学院作物研究所小麦育种室提供。以转基因小麦材料为母本,分别与5个推广小麦品种进行杂交获得F1,自交获得F2群体。
利用CTAB法提取供试小麦幼嫩叶片的基因组DNA[15]。PCR 引物序列为:PSAG12-F:5′-GCAAAGAGACGGGAAGAAA-3′,PSAG12-R:5′-TGGCTGAAGTGATAACCGTC-3′[7]。
PCR扩增体系为10 μL,包括5 μL 2×Taq master(2×Taq PCR Buffer, 3 mmol·L-1MgCl2,400 μmol·L-1dNTP mix),DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,灭菌双蒸水2 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性1 min,56 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸7 min,最后4 ℃保存。利用2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)检测PCR产物[16]。
从上述杂交组合F2群体中,每个组合随机选择30株,参考Arnon[17]、薛 香等[18]的方法测定旗叶叶绿素含量,并做少许改动。具体步骤为:于小麦抽穗期剪取小麦旗叶,立即放入液氮中保存;称取0.2 g待测叶片,剪碎后放入 50 mL量杯中,加入20 mL酒精,封口,并在黑暗中放置 24 h,中间震荡数次,至叶片完全变白;在665和649 nm下测定提取液吸光度,分别用OD665和OD649表示,并计算叶绿素含量。叶片中叶绿素含量的计算公式:CFL=6.63×OD665+18.08×OD649;叶片中叶绿素的相对含量计算公式:
C=CFL/FW×100%,FW为样品鲜重。
采用卡方(χ2)法检验F2群体中携带PSAG12-IPT基因植株与不携带PSAG12-IPT基因植株的分离情况。利用SPSS 10.0软件对旗叶叶绿素含量进行差异显著性分析,差异显著性用LSD法来表示;利用Sigmaplot 12.0软件绘制柱形图,并利用PhotoShop CS 6.0软件处理图片。
每个组合分别提取F1代植株的幼嫩叶片(10株),从其PCR检测结果(图1)发现,这50个株系均能扩增出526 bp的目标片段,说明F1单株均携带PSAG12-IPT基因。从每个组合的F2代群体中,随机选取30株,对PSAG12-IPT基因进行PCR检测,结果5个组合中携带PSAG12-IPT的植株与不携带PSAG12-IPT植株的比例分别为 22∶8、24∶6、21∶9、20∶10和23∶7(表1)。卡方测验表明,PSAG12-IPT以单基因的形式在子代中稳定遗传。
M:DL2000;ZH1:组合1-F1;ZH2:组合2-F1;ZH3:组合3-F1;ZH4:组合4-F1;ZH5:组合5-F1;T1376:TIPT-XN1376;1:西农1376;2:陕麦159;3:周麦18;4:远丰175;5:西农979;6:郑麦9023。
表1 PSAG12-IPT在F2群体中的遗传分析
由图2可知,携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比其父本以及不携带PSAG12-IPT的株系均有显著提高。与亲本西农1376相比,转基因株系TIPT-XN1376的叶绿素含量增加了9.1%;组合1-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了 6.0%;组合2-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了10.5%;组合3-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了4.2%;组合4-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了9.9%;组合5-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了5.4%。
1:TIPT-XN1376;2:西农1376;3:组合1-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系;4:组合1-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系;5:陕麦159;6:组合2-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系;7:组合2-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系;8:周麦18;9:组合3-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系;10:组合3-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系;11:远丰175;12:组合4-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系;13:组合4-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系;14:西农979;15:组合5-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系;16:组合5-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系;17:郑麦9023。误差线表示重复间的误差,图柱上不同字母表示品系间差异显著(P<0.05)。
植物的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关[1-3]。不论是控制质量性状的基因还是控制数量性状的基因,基因在子代的传递过程都遵循孟德尔遗传规律[19-21]。然而,关于转基因株系中被转入基因遗传特点的研究还未见报道。本研究以转基因株系TIPT-XN1376与普通小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023杂交获得的F2群体为试验材料,利用PSAG12-IPT基因的特异分子标记[7]进行PCR检测,结果表明,150个后代中,转基因株系中携带PSAG12-IPT植株与不携带PSAG12-IPT植株的数目比例为110∶40,χ2检验结果表明,符合3∶1的遗传特点,即转基因株系TIPT-XN1376中PSAG12-IPT基因是以单拷贝的形式存在的,并且其遗传符合孟德尔单基因遗传规律。
目前,已将PSAG12和IPT共表达载体转入多种植物,发现转基因植株抗逆性明显增强、衰老速度延缓,光合作用、氮素分配也发生明显改变[6-14]。然而关于PSAG12-IPT基因延缓普通小麦衰老的研究较少。本研究测定了转基因株系、受体亲本及其转育后代旗叶的叶绿素含量,结果发现,5个组合F2群体中携带PSAG12-IPT的株系中旗叶叶绿素含量(平均55.4 mg·g-1)均比不携带PSAG12-IPT的株系(平均51.7 mg·g-1)显著提高,平均提高7.2%,说明PSAG12-IPT基因能够降低植株叶片叶绿素降解速率,使叶片维持较长的持绿时间。然而,尽管PSAG12-IPT嵌合基因在叶片衰老时表达,从本研究初步测定结果看,转基因后代叶片叶绿素含量也表现明显升高的趋势,这对于植株整体形态保持和提高生物学产量是非常有利的,但是这种生理上的变化与转入基因的关系有待进一步确认和研究。