柴胡加龙骨牡蛎汤对急性心肌梗死合并焦虑小鼠血清ACTH及CORT的影响

杜泓森　史金玉　王帅　安莹　靳会会　贾静芸　赵海滨

摘要 目的：观察柴胡加龙骨牡蛎汤对AMI合并焦虑小鼠血清ACTH及CORT的影响。方法：将30只小鼠随机分为假手术组、AMI组、焦虑组、AMI+焦虑组、中药组，每组6只，以冠脉结扎法合并空瓶刺激法制作复合模型，予柴胡加龙骨牡蛎汤干预14 d。造模结束后，予行为学及心脏彩超检测，后处死取各组血清检测ACTH及CORT含量。结果：与假手术组比较，AMI组小鼠LVEF和LVFS明显降低，LVEDd及LVESd值明显增加;AMI组及焦虑组小鼠水平和垂直运动得分均降低，开放臂进入次数和停留时间均减少;焦虑组ACTH和CORT含量增加;AMI组仅ACTH含量增多。与AMI+焦虑组比较，AMI组、焦虑组及中药组的LVEF、LVFS升高，LVEDd值明显较低;水平和垂直运动得分均升高;血清ACTH和CORT含量均降低。LVESd值仅AMI组及焦虑组降低;AMI组及中药组的OE%增加、OT%延长，焦虑组仅OT%延长。结论：柴胡加龙骨牡蛎汤抗焦虑、改善AMI预后的疗效机制可能与抑制ACTH和CORT含量的升高有关。

关键词 柴胡加龙骨牡蛎汤;AMI合并焦虑;小鼠;血清;疗效;机制;ACTH;CORT

Abstract Objective：To observe effects of Chaihu Plus Longgu Muli Decoction on serum ACTH and CORT in mice with acute myocardial infarction（AMI）complicated with anxiety.Methods：Thirty mice were randomly divided into sham operation group， AMI group， anxiety group， AMI+anxiety group and traditional Chinese medicine group（n=6）.The compound model was made through coronary artery ligature combined with empty bottle stimulation and intervened by Chaihu Plus Longgu Muli Decoction for 14 d.After the establishment of the model， behavioral and Echocardiography detection was conducted.After execution， contents of ACTH and CORT in the serum in each group were detected.Results：Compared with the sham operation group， LVEF and LVFS in the AMI group were significantly decreased， while LVEDd and LVESd were significantly increased.Scores of horizontal and vertical movements in the AMI group and the anxiety group were decreased， while open arm entry times and residence time were decreased.The ACTH and CORT contents were increased in the anxiety group， and only the ACTH content was increased in the AMI group.Compared with the AMI+anxiety group， the LVEF and LVFS in the AMI， anxiety and traditional Chinese medicine groups were significantly increased， while the LVEDd values were significantly decreased; the horizontal and vertical movement scores were increased; and the serum ACTH and CORT contents were decreased.The LVESd values were decreased only in the AMI and anxiety groups.OE% was increased and OT% was prolonged in the AMI and traditional Chinese medicine groups， and only OT% was prolonged in the anxiety group.Conclusion：The therapeutic mechanism of Chaihu Plus Longgu Muli Decoction in anti-anxiety and improving the prognosis of AMI may be related to the inhibition of the increase of ACTH and CORT contents.

Keywords Chaihu Plus Longgu Muli Decoction; AMI with anxiety; Mice; Serum; Efficacy; Mechanism; ACTH; CORT

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.02.021

近年来，大量证据表明急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）与焦虑共病的概率及死亡率正逐步升高。研究发现，在AMI后3个月内，焦虑的发病率约30%，远远高于在普通人中的发病率（5%～10%）[1]。反过来，焦虑已被确定为冠心病发生发展的独立危险因素，其发生心绞痛的概率是非焦虑患者的2倍，发生不良心血管事件的概率也升高至2～5倍，严重影响AMI的远期预后[2-4]。由此可见AMI与焦虑密切相关，二者相互影响，共同促进疾病的发生发展。然而目前冠心病合并焦虑的发病机制仍不明确，研究表明其可能与下丘脑-垂体-肾上腺素（Hypothalamic Pituitary-adrenal Axis，HPA）轴活性异常亢进有关[5]。本团队前期研究表明，柴胡加龙骨牡蛎汤能有效提高冠心病合并焦虑患者生命质量，改善其心绞痛发作频率和时间、不良心血管事件发生率及焦虑情绪[6]。因此，本研究拟通过观察柴胡加龙骨牡蛎汤对AMI合并焦虑小鼠心功能、焦虑程度，及血清肾上腺皮质激素（Adreno Cortico Trophic Hormone，ACTH）和皮质醇（Corticosterone，CORT）含量的影响，揭示其改善AMI合并焦虑预后的部分作用机制，为其在临床广泛应用提供基础支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，平均体质量（23±2）g，由北京华阜康实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2014-0004。喂养环境清洁，温度21～24 ℃，相对温度40%～65%，标准饲料喂养，12 h/12 h明暗交替。

1.1.2 藥物 柴胡加龙骨牡蛎颗粒，配方：柴胡12 g、龙骨15 g、牡蛎15 g、桂枝9 g、茯苓15 g、黄芩9 g、大黄9 g、半夏9 g、生姜9 g、大枣10 g、党参9 g、珍珠母（代铅丹）15 g，由北京康仁堂药业有限公司提供。

1.1.3 试剂与仪器 血清皮质酮（CORT）试剂盒（货号：MU30431），促肾上腺皮质激素（ACTH）试剂盒（货号：MU30269）均购于武汉博奥特公司;气麻机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：R580S）;高架十字迷宫、旷场装置：自制。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 AMI模型：采用异氟烷吸入法麻醉小鼠，仰卧位固定，左胸备皮，消毒。在左胸骨旁剪开约1.5 cm长度切口，用镊子小心钝性分离肌肉，用止血钳在3、4肋间隙穿透胸膜，暴露心脏，同时关闭麻醉机，立即挤出心脏，用6～0丝线在左心耳下缘约2 mm处进针，深度约为1～1.5 mm，从肺动脉左缘出针，见结扎区心肌组织变白可视为手术成功，迅速心脏复位，同时挤压胸廓以减轻气胸，随后用5～0线缝皮，将其置于电热毯上，待苏醒后转移回笼内。术后肌注青霉素40万U预防感染。假手术组只穿线不结扎。焦虑模型：采用不确定空瓶刺激法，造模周期共21 d。第1～7天，每天9：00-9：10、21：00-21：10 2个时间段予饮水;第8～21天，每天上述2个时间段内分别随机给予空瓶或喂水。造模期间小鼠自由饮食。AMI+焦虑模型：在焦虑造模第15天对小鼠进行AMI手术，之后继续空瓶刺激。采用随机数字表分为假手术组、AMI组、焦虑组、AMI+焦虑组、中药组，每组6只。

1.2.2 给药方法 课题组前期实验证明按临床剂量6倍折算为动物药效最佳浓度。据此将每剂中药颗粒用蒸馏水配置为100 mL，混匀，予中药组灌胃（0.1 mL/10 g，折合生药量13.6 g/kg），其余各组灌胃蒸馏水（0.1 mL/10 g），1次/d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 旷场实验（Open Field Test，OFT） 实验装置为木制箱100 cm×100 cm×40 cm，底板共计25个方格，大小为20 cm×20 cm。开始实验时，将小鼠置于场箱最中间，观察其水平运动所跨格子数及垂直站立次数，共计5 min：每越过一个格子记1分，每直立1次记1分，计算小鼠的水平和垂直运动得分。每只小鼠测试完后用乙醇擦拭以清除残留异味，晾干后进行下一只测试。

1.2.3.2 高架十字迷宫实验（Elevatedplus Maze，EPM） 将小鼠置于中央区，面向开放臂放入，记录5 min内的活动情况。观察指标：进入开放臂次数（Open arm Entry，OE）、进入闭合臂次数（Close arm Entry，CE）、进入开放臂时间（Open arm Time，OT）和进入闭合臂时间（Close arm Time，CT）。分别计算进入开放臂次数比OE%=OE/（OE+CE）×100%、OT%=OT/（OT+CT）×100%。同上清洁装置。

1.2.3.3 心脏超声检查 异氟烷吸入性麻醉小鼠，仰卧固定，左胸前备皮，运用Visual Sonices Vevo 2100高分辨小动物超声系统探测左室短轴切面M型曲线，记录左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd），并计算左室射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）。取3个连续心动周期，计算其平均值。对超声医师施盲，以最大可能获得客观真实的数据。

1.2.3.4 酶联免疫吸附法（Elisa） 麻醉小鼠，固定，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80 ℃冻存保存至测定，参照试剂盒说明检测ACTH、CORT含量。

1.2.3.5 HE及Masson染色 暴露胸腔，在心尖处插入灌流器，剪开右心耳，注入10%中性福尔马林溶液，灌注成功后摘取心脏，于10%中性福尔马林溶液中浸泡48 h，脱水、透明、包埋、切片，行HE和Masson染色，观察梗死边缘区组织变化。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，先进行正态检验。符合正态且方差齐采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步用LSD检验进行两两比较，方差不齐，则采用Welch检验，并用Games-Howell进行两两比较。不符合正态，采用K个独立样本的非参数检验。所有数据用均值±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏超声检测 与假手术组比较，AMI组小鼠LVEF和LVFS明显降低，LVEDd及LVESd值明显增加;而焦虑组均无明显变化。与AMI+焦虑组比较，AMI组、焦虑组及中药组的LVEF、LVFS明显升高，LVEDd值明显较低;另AMI组及焦虑组的LVESd值也降低，中药组则无明显统计学变化。见表1、图1所示。

2.2 行为学检测

2.2.1 旷场實验 与假手术组比较，AMI组及焦虑组的小鼠水平和垂直运动得分均降低。与AMI+焦虑组比较，AMI组、焦虑组及中药组的水平和垂直运动得分均升高。见表2，图2。

2.2.2 高架十字迷宫实验 与假手术组比较，AMI组及焦虑组小鼠的开放臂进入次数和停留时间均减少。与AMI+焦虑组比较，AMI组及中药组的OE%增加、OT%延长，焦虑组仅OT%延长。如表2、图3所示。

2.3 心肌梗死边缘区HE和Masson染色

2.3.1 HE染色 假手术组心肌细胞排列整齐，结构完整，胞质着色均匀。焦虑组心肌细胞排列与假手术组比较有所紊乱，细胞间隙轻度增宽;AMI组心肌细胞排列明显紊乱，核固缩或碎裂，心肌纤维溶解断裂;AMI+焦虑组心肌细胞损伤程度更大，心肌纤维断裂进一步加重。与AMI+焦虑组比较，中药组心肌细胞损伤程度有所减轻，心肌纤维排列较为整齐。见图4。

2.3.2 Masson染色 心肌细胞与胶原纤维分别呈红染、蓝染。假手术组心肌细胞排列整齐，无明显胶原纤维增生。焦虑组心肌细胞较假手术组排列轻度紊乱，蓝染胶原纤维也不明显;AMI组心肌细胞排列松散紊乱，可见大量胶原纤维;AMI+焦虑组心肌细胞排列紊乱程度更大，蓝染胶原纤维量更多。中药组心肌细胞排列紊乱程度比AMI+焦虑组较轻，胶原纤维含量有所减少。见图5。

2.4 各组血清ACTH及CORT含量 与假手术组比较，焦虑组小鼠血清ACTH和CORT含量升高;AMI组仅ACTH含量增多。与AMI+焦虑组比较，AMI组、焦虑组及中药组小鼠的血清ACTH和CORT含量均降低。见表3，图6～7。

3 讨论

焦虑与AMI可相互影响，共同促进AMI合并焦虑的不良预后。本研究心脏彩超、行为学及心肌病理染色结果证实，焦虑可以加重AMI小鼠的心肌损伤程度，反过来AMI术产生的心肌损伤也会加重小鼠的焦虑程度。进一步地，比较于单纯焦虑组、AMI组，AMI合并焦虑组小鼠的心功能最差、焦虑程度最高。因此，明确AMI合并焦虑的共病机制并予以有效干预十分重要。

《伤寒论》第106条曰：“伤寒八九日，下之，胸满烦惊，小便不利，谵语，一身尽重，不可转侧者，柴胡加龙骨牡蛎汤主之”。其中“烦惊”“谵语”类似于焦虑症状，“胸满”“小便不利”“一身尽重，不可转侧”则与冠心病症状相似。研究发现当前柴胡加龙骨牡蛎汤被广泛应用于精神情志类疾病治疗，高达39.08%，其次为神经系统及循环系统类疾病，分别占16.09%、10.34%[7]，能明显缓解焦虑抑郁程度，减轻心肌损伤[8-9]。团队前期研究也表明柴胡加龙骨牡蛎汤可明显改善冠心病合并焦虑状态患者的焦虑状态和心功能，发挥解郁理气、活血安神的功效，其作用机制可能与促进体内外骨髓间充质干细胞循环、调节肠道菌群、减轻炎性反应、抑制血小板活化、增加心率变异性等有关[10-13]。

HPA轴功能与人体应激反应关系十分密切。下丘脑可在人体受到应激时释放肾上腺皮质激素释放因子CRF，后者可进一步刺激垂体前叶、肾上腺皮质分泌ACTH、CORT;而CORT和ACTH又能负反馈作用于CRF，以调节HPA轴功能[14]。当人体受到持续性刺激时，HPA轴过度活化，ACTH和CORT分泌显著增多，促使交感神经兴奋性增强，心率加快，心率变异性降低，而炎性反应及血小板活性、血管收缩力均增强，引发血管内皮受损，继而导致冠心病发生风险增强;同时，脑源性神经营养因子减少，海马神经元受损，也促进了情绪障碍的发生发展[15-19]。因此，减轻应激反应，降低HPA的亢奋程度，能有效缓解焦虑状态和AMI后心肌损伤情况，改善AMI合并焦虑的预后。有报道更进一步指出，皮质醇检测可能会被纳入常规检测，来评估人们的焦虑及冠心病风险，并成为缓解焦虑及降低冠心病发病率的靶标之一[20]。

血清中ACTH和CORT的水平可直接反应HPA轴的功能状态。已有研究表明，AMI后抑郁大鼠血清中ACTH、CORT水平均明显升高[21]。本研究中各组小鼠血清ACTH和CORT的含量变化表明，AMI可加重焦虑小鼠HPA轴亢进的程度，反过来焦虑也可加重AMI小鼠HPA轴亢进的程度;同时柴胡龙骨牡蛎汤可减轻AMI合并焦虑小鼠的HPA轴亢进程度。由此表明，HPA轴亢进是AMI与焦虑共病的机制之一，而柴胡龙骨牡蛎汤可能是通过抑制HPA轴中ACTH和CORT含量的升高，进而发挥抗焦虑、改善AMI预后的疗效。本研究仅观察柴胡龙骨牡蛎汤对AMI合并焦虑小鼠行为及部分激素含量的影响，而中药具有多靶点效应，加之冠心病与焦虑的共病机制十分复杂，现代医学尚不明确，因此柴胡加龙骨牡蛎汤的更多作用机制还有待进一步的研究探索。

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（2019-08-16收稿 责任编辑：王明）