SIRT1通过抑制卵母细胞衰老改善卵巢储备功能的研究进展

王宝娟，宫政，宋佳怡，夏天，马瑞红

当今，随着环境污染的日渐加重、生活节奏的逐步加快、行业竞争的逐渐激烈、生活压力的日益增大及饮食结构的不断改变，不孕不育的发病率也明显上升。我国育龄女性不孕不育的发病率已由1980年的2%提升至2018年底的20%，平均每8对夫妇中，就有1对夫妇存在不孕不育问题，加之“全面二孩”政策的放开，越来越多的高龄女性涌入“生二胎”的大潮中。然而，高龄不孕女性随年龄增长导致的卵母细胞衰老、卵巢储备功能下降进而造成生育力的急剧下滑仍是生殖领域的瓶颈问题。尽管辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART） 给不孕症女性带来福音，但是在卵巢储备功能较差的女性群体中，由于卵母细胞数量的减少与质量的下降致使胚胎质量不佳，导致ART结局往往不尽如人意[1]。相当一部分患者历经多次胚胎移植依旧无法如愿妊娠，胚胎移植程序的反复进行增加了患者的经济及心理负担，严重影响患者生活质量。因此，改善卵巢储备功能不仅是提高ART成功率的重要因素，也是生殖领域亟待解决的重点问题。

沉默信息调节因子2相关酶类1（silent information regulator 2 of transcription 1，SIRT1） 是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的组蛋白脱乙酰酶，是Sirtuins家族成员之一。大量研究显示，SIRT1与人类因衰老导致的一系列生理病理变化息息相关[2]。SIRT1调节生育力的作用最早报道于2003年，McBurney等[3]在SIRT1缺失小鼠中观察到有缺陷的生殖表型：与正常小鼠相比，SIRT1缺失小鼠卵巢较小，虽然存在各级发育的卵泡但不能正常排卵。而后关于Sirtuins在生殖生物学方面的研究逐渐增多。近年研究表明，SIRT1是调节卵子发生和细胞应激反应关键过程的重要参与者[4]，SIRT1信号通路在抑制卵母细胞衰老、提高卵巢储备功能、延长卵巢寿命中发挥作用，或可改善卵巢储备功能、提高卵母细胞质量，增加ART过程中的获卵数、成胚率及临床妊娠率。故本文就SIRT1通过抑制卵母细胞衰老改善卵巢储备功能的相关机制研究进行综述。

1 SIRT1简介

Sirtuins家族是一组依赖NAD+发挥作用的去乙酰化酶类和二磷酸腺苷（ADP）-核糖转移酶[5]。人类Sirtuins家族中公认的成员有7个：SIRT1～SIRT7。SIRT1基因位于人类第10对染色体上，基因组序列长度约33.72 kb，起始于第67 884 669碱基对，到第67 918 390碱基对结束，具有高度保守性[6]。SIRT1蛋白具有自ADP-核糖转移酶活性和底物特异性脱乙酰酶活性[5]。SIRT1蛋白广泛表达于各种体细胞及生殖细胞中，主要定位于细胞核。其在热量摄入不足时可以被白藜芦醇（resveratrol）、褪黑素、SRT1720（SIRT1激活剂）等化合物激活[7-8]，进而调控相关微小RNA（microRNAs，miRNAs）和转录因子，包括p53、叉头蛋白盒转录因子1（fork head protein box transcription factor 1，FOXO1）、FOXO3、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（polyadenosine diphosphate ribose polymerase-1，PARP-1）、miR-181a、核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）等，从而参与体内多种生理功能的调节，包括细胞增殖、分化、凋亡和代谢，并在这些过程中发挥中心调控点的作用[4]。

2 卵母细胞功能是卵巢储备功能的重要评价指标

卵巢储备功能的评价包括始基卵泡池的卵母细胞数量及质量。卵原细胞从卵黄囊内胚层迁移至生殖嵴，而后通过有丝分裂增殖，形成初级卵母细胞，初级卵母细胞第一次减数分裂保持在双线期，前体颗粒细胞围绕部分双线期的卵母细胞形成始基卵泡[9]。始基卵泡是雌性个体的基本生殖单位，是卵细胞储备的唯一形式，始基卵泡池的建立在胎儿期间启动（即真正的卵巢储备）。没有被前体颗粒细胞包绕的剩余卵母细胞则发生凋亡[9]。

在发育的不同阶段中，99.9%的卵母细胞发生凋亡，其中1/3的凋亡发生在始基卵泡池形成后，主要集中在减数分裂前期Ⅰ中的粗线期。在哺乳动物卵巢中，休眠的始基卵泡池是整个生殖期间发育卵泡和受精卵的来源。卵母细胞的全面发育能力需要同步的核成熟和细胞质成熟[10]。卵母细胞质由许多细胞器和分子组成，每个细胞器和分子都必须处于适当的状态才能使其有能力维持次级胚胎的发育。卵母细胞中纺锤体、颗粒细胞和线粒体的任何功能障碍或错位都会降低卵母细胞的功能。

3 SIRT1抑制卵母细胞衰老的相关机制研究

3.1 SIRT1通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-protein kinase，PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信号通路调控卵母细胞数量 PI3K-AKT信号通路是始基卵泡激活的一个重要中枢途径。SIRT1是PI3K诱导的AKT活化所必需的一环[11]。Long等[12]研究发现，SIRT1敲入小鼠原始卵泡的数量和百分比均高于野生型小鼠，闭锁卵泡数则较野生型小鼠少，这可能是由于SIRT1对于卵母细胞内PI3KAKT信号通路相关调节因子的重要作用。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10，PTEN）作为该途径的负调节因子，抑制始基卵泡激活的启动[13]，而激活SIRT1可抑制该通路在小鼠卵巢中激活，防止始基卵泡丢失[14]。FOXO3是PI3K-AKT通路的下游效应因子，具有抑制始基卵泡激活的作用[11,15]。Long等[12]研究观察到卵母细胞特异性SIRT1高表达小鼠通过去乙酰化持续激活FOXO3，从而抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的产生，进而保护卵巢储备功能。其中，mTOR是PI3K-AKT信号通路另一组分核糖体蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）-核糖体蛋白S6（ribosomal protein S6，RPS6）的调控因子，mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶代谢传感器，可根据生长因子和营养物质调节细胞生长和增殖，并调节始基卵泡的激活途径[16]。mTOR刺激物可促进始基卵泡的激活，而mTOR抑制剂抑制卵巢中mTORC1或mTORC1/2，进而阻断始基卵泡转变为初级卵泡，维持始基卵泡计数[17]。因此，SIRT1激活mTOR-PI3K-AKT信号通路可抑制始基卵泡发育的启动，减少始基卵泡向初级卵泡转化并抑制始基卵泡凋亡，有助于保留卵巢储备功能。

3.2 SIRT1通过抑制颗粒细胞凋亡影响卵母细胞质量 颗粒细胞包裹在卵母细胞周围，与卵母细胞联系密切，其生长和凋亡状态可以调节卵泡的发育和凋亡过程，进而影响卵母细胞的质量[18]。一方面，颗粒细胞包裹卵泡形成微环境，运输生长因子、营养物质和细胞存活分子至卵母细胞，为卵母细胞发育提供能量；另一方面，颗粒细胞可贮存和释放分子信号来激活始基卵泡、选择优势卵泡并介导调控卵母细胞成熟。

研究证实，SIRT1表达水平的下调可导致颗粒细胞凋亡增加，从而出现卵巢储备功能降低，甚至发生卵巢早衰[19]。而激活SIRT1则可抑制颗粒细胞凋亡，Itami等[20]研究显示，SIRT1激活剂白藜芦醇可修复卵母细胞损伤，显著改善卵母细胞质量。

此外，SIRT1参与类固醇激素合成关键酶的表达调控和哺乳动物的生殖过程。雌激素合成主要在卵泡内进行，在促进颗粒细胞生长、增殖和卵泡发育中发挥关键功能。既往研究表明，SIRT1可影响小鼠雌激素分泌，在SIRT1基因敲除小鼠中，雌激素受体α（ERα）表达水平下降，导致ERα介导的雌激素相关基因表达水平下降[21]。另有研究表明，用SIRT1-短发夹RNA（SIRT1-shRNA）转染牛卵巢颗粒细胞，其雌激素分泌水平明显减少，认为干扰SIRT1基因表达可显著抑制颗粒细胞凋亡且减少雌激素的分泌[22]。

3.3 SIRT1通过抑制氧化应激延缓卵母细胞衰老 SIRT1是卵母细胞、颗粒细胞和早期胚胎氧化还原状态的传感器，其可以抑制氧化应激对卵母细胞产生的不良影响。抑制SIRT1会促进活性氧簇（ROS）的产生和抗氧化系统[包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等]的耗竭，加快卵母细胞的凋亡速度[23]。研究证实，体外成熟的MⅡ卵母细胞经SIRT1抑制剂烟酰胺（NAM）处理后，ROS表达水平增加，卵母细胞纺锤体缺陷发生率增加，线粒体分布紊乱[24]。

SIRT1的氧化还原相关靶分子主要是p53和FOXO，它们在调节SIRT1对氧化还原状态变化的反应中发挥不同作用。p53是一种转录因子，参与抗氧化系统中SOD2和GPX1的激活过程。SIRT1和p53的活性可相互调节，SIRT1使p53去乙酰化来抑制p53依赖性转录和凋亡，进而修复因应激而引起的DNA损伤，减少细胞凋亡[25]。同时，在SIRT1启动子区域中存在p53结合位点，活化的p53可以抑制SIRT1的翻译[26]。FOXO是SIRT1重要的下游调控因子之一，SIRT1通过与FOXO转录因子配合来影响锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的水平，进而抵消氧化应激所造成的细胞损伤[27]。此外，Sirtuins使FOXO家族的一些成员去乙酰化，如FOXO1和FOXO3a，从而降低其磷酸化水平防止其失活，最终使其与DNA的结合能力升高。其中，FOXO1蛋白在胎儿、青春期前和成年卵巢颗粒细胞中表达，SIRT1使FOXO1去乙酰化，进而抑制氧化应激引起的颗粒细胞自噬性凋亡[28]。SIRT1对FOXO3a的去乙酰化导致MnSOD和CAT水平增加[29]，进而增加了蛋白质的表达，保护颗粒细胞免受氧化应激伤害。

此外，越来越多的证据表明颗粒细胞会因氧化应激而凋亡，进而损害卵泡的发育，加速卵巢的老化，与女性不育密切相关[30]，因此SIRT1对女性生育能力至关重要[23]。

3.4 SIRT1通过调节线粒体功能影响卵母细胞质量

3.4.1 线粒体对卵母细胞的影响一些假说认为线粒体是决定生殖能力的关键因素，并提出颗粒细胞、卵母细胞和营养外胚层细胞的线粒体DNA含量是衡量卵母细胞质量的重要生物标记物[31]。卵子在排卵之前经历的所有复杂过程都需要能量，能量也主要来自由线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）产生的三磷酸腺苷（ATP），线粒体结构变化导致高度活跃的氧化代谢和ATP产生会影响卵母细胞质量。同时相关研究证明，线粒体的老化或损伤会加剧卵子的氧化应激损伤，导致卵母细胞内非整倍体比例增加、染色体缺失和分离异常[32]，进而对胚胎发育产生不良影响。

3.4.2 SIRT1对线粒体功能的影响线粒体生物发生是由过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子 1 （peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1）蛋白家族成员提供的，主要是PGC-1α，它是线粒体生物发生的有效诱导剂，参与调节线粒体内稳态。SIRT1通过腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）-细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulatedkinase，ERK）-线粒体融合蛋白2（mitochondrial fusion protein 2，Mfn2）轴激活PGC-1α[33]。激活SIRT1可提高磷酸腺苷（AMP）/ATP比值，激活AMPK，增加NAD+水平及NAD+所依赖的SIRT1脱乙酰酶活性。AMPK和SIRT1可分别通过磷酸化和去乙酰化激活pGC-1α，进而诱导线粒体生物发生从而抵御氧化应激并产生能量[34]。已有研究表明，激活SIRT1可有效促进线粒体降解和生物学活性的发生，进而提高卵母细胞质量[35]。随着人类的衰老，始基卵泡池不仅越来越小，衰老细胞还会产生更多的SOD破坏线粒体并干扰线粒体稳态[36]。SIRT1可以减轻线粒体损伤，维持线粒体稳态，进而改善线粒体功能和卵母细胞质量。

4 结语

卵巢储备功能降低患者由于卵母细胞数量减少及质量下降，导致生育潜能降低，长期不孕及反复体外受精（IVF）失败使此类患者承受了更多精神及经济压力。因此，延缓卵母细胞衰老、提高卵巢储备功能已成为生殖领域亟待解决的问题。SIRT1可通过PI3K-AKT信号通路调控卵母细胞数量；可抑制颗粒细胞凋亡，改善卵母细胞质量；可抑制氧化应激，延缓卵母细胞衰老；还可有效促进线粒体降解和生物学活性的发生，进而提高卵母细胞质量。但SIRT1抑制卵母细胞衰老改善卵巢储备功能的现有研究多为动物研究，尚缺乏临床证据，仍需进一步验证。