环状RNA在肝细胞癌中的研究进展

陆滢雪 综述 罗新华 审校

(1.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004；2.贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002)

高通量测序技术的发展使大量非编码RNA被发现。ncRNA参与许多疾病的病理过程。近20年来，人们鉴定出许多种类ncRNA，如长链非编码RNA (lncRNA)、miRNA(micro RNA)和circRNA[1]。circRNA于1976年被发现，曾被认为是前体mRNA (pre-mRNA)错接的副产品，至今已发现了上万种。circRNA主要由外显子或内含子序列产生，反向互补序列或RNA结合蛋白(RBPs)是环状RNA生物发生的必要条件。最近的报道[2]显示，circRNA可以作为microRNA (miRNA)海绵来保护mRNA的翻译，通过剪接和转录过程来影响亲代基因的表达，或者与蛋白质相互作用来影响其功能。有证据[3]表明，circRNA参与了HCC的发生，并在许多生物学过程中发挥了关键作用。circRNA可作为一种潜在的诊断生物标志物和治疗靶点，而circRNA在HCC中的潜在机制目前尚不清楚。

1 circRNA 的形成

circRNA 主要有3种类型：外显子来源的circRNA(ecircRNA)、内含子来源的circRNA(ciRNA)、外显子—内含子circRNA。目前发现的circRNA，80%为ecircRNA。ecircRNA的形成机制主要有两种途径：套索驱动环化和内含子配对驱动环化。ciRNA主要通过自我剪接内含子形成。EIciRNA的形成机制目前尚未研究清楚。

2 circRNA的分子特征

(1)circRNA广泛存在于真核生物体的不同组织，如睾丸、大脑、胃、乳腺和前列腺等，多数位于细胞质，少数位于细胞核，非常稳定，不易被核酸外切酶RNaseR降解。(2)circRNA序列高度保守，具有细胞、组织类型特异性和阶段特异性。(3)大多数circRNA由蛋白质编码基因的外显子组成，少数由内含子或内含子片段直接环化形成。(4)作为miRNA海绵竞争性结合miRNA的结合位点，使miRNA失去其自身功能及对下游靶基因的调节功能。(5)多数circRNA在转录后发挥调控作用，少数只能在转录水平发挥调控作用。(6)与蛋白质相互作用，miRNA效应器可以与circRNA结合而被降解。同时，circRNA通过与蛋白质相互作用参与调节细胞的多种生理过程。(7)参与蛋白质翻译，大多数circRNA为ecircRNA，主要存在于细胞质中，因此，可以装载至核糖体中，并翻译成多肽。

3 circRNA的功能

一些具有相同miRNA应答元件的RNA可以竞争性结合miRNA位点来影响miRNA对其靶基因的作用，从而影响肿瘤的生物学行为，称为miRNA的“海绵作用”(miRNA sponge)。circRNA也能够竞争性结合miRNA位点，影响miRNA及下游靶基因的表达。circRNA通过应答元件与miRNA相互关联后，既可以作为肿瘤抑制因子，又可以作为一种原癌基因在肿瘤的发生、发展过程中发挥作用。竞争性内源性RNA(ceRNAs)包含mRNA、假基因转录物、lncRNAs和circRNA ，可以竞争结合miRNA。因此，ceRNAs的存在或缺失会影响miRNAs对基因表达的调控。如果ceRNA基因表达出现失调，就可能发生疾病。

4 HCC中的circRNA

HCC恶性程度高，复发率高，对多种化疗药物耐药，预后差。HCC通常通过血液或淋巴转移，只要发生转移就很难控制[4]。然而，HCC缺乏有效的临床预测、诊断和治疗方法，促使科学家寻找更好的肿瘤标志物。最近，研究人员发现ncRNA尤其是环状RNA的失衡表达在HCC中更为常见，与疾病的发展密切相关。这一现象表明，科学家可能能够在circRNA领域阐明HCC的发病机制，找到HCC的治疗靶点。

5 作为HCC的抑制剂或促进剂

circRNA具有大量的miRNA结合位点，这些位点有助于circRNA与miRNA相互作用[5]。研究[6]证明circRNA可以通过与miRNA相互作用调控亲本基因的表达。has_circ_0005075可能与四种miRNA相互作用，包括hsa-miR-23b-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-581和hsa-miR-23 a-5p，从而抑制这些miRNA的表达和功能，提示HCC中has_circ_0005075的高表达水平与肿瘤进展相关，has_circ_0005075可能作为一种新的HCC生物标志物[7]。

从circRNA芯片分析中筛选出的circ_100338的上调与肝癌合并HBV感染患者的累积低生存率密切相关,且与肝癌的转移进展呈正相关。circ_100338作为miR-141-3p的海绵,可被miR-141-3p拮抗,抑制肝癌细胞转移进展。miR-141-3p过表达对侵袭能力的抑制可通过miR-141-3p和circ-100338在MHCC97H细胞中共表达来恢复。同样，circ_100338诱导的MHCC97H细胞迁移和侵袭能力的增强也可以通过miR-141-3p上调来挽救。这些结果表明，circ_100338作为一种新的生物标志物，在HBV相关的HCC患者的诊断和患者生存评估中具有潜在价值。

多种信号通路已被报道参与HCC的病理机制。FZD5据报道为受体和Wnt/β-catenin信号通路的催化剂。hsa_circ_0067934可以通过Wnt/β-catenin信号通路吸附mir-1324海绵，使其在HCC中表达上调。miR-1324可以靶向FZD5的3′-UTR 损害 Wnt/β-catenin信号通路的激活。敲低circ-0067934或miR-1324过表达既能下调FZD5表达和抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,显著抑制肝癌细胞系Hep3B和HuH7细胞增殖、迁移和入侵。结果表明,circ_0067934/miR-1324/FZD5/Wnt/β-catenin信号轴可能作为一种很有前途的HCC干预的目标。进一步研究发现miR-129-5p靶点hsa_circ_0005986明显低于正常组织[8]。hsa_circ_0005986低表达水平与慢性乙型肝炎家族史、肿瘤直径、微血管浸润和BCLC阶段有关，而实验显示hsa_circ_0005986释放miR-129-5p下调和减少Notch1-mRNA的表达水平相关。有趣的是，hsa_circ_0005986的下调通过促进G0/G1向S期转变，从而促进细胞增殖。前期实验提示，这种转变受到G0/G1调节基因2(G0S2)的调控，G0S2可能是通过激活HCC细胞增殖的重要调控因子PPARα，是脂肪酸在肝脏分解代谢的关键调节器[9]，因此hsa_circ_0005986通过调节细胞增殖，参与肝癌HCC进展。

有研究[10-11]分析了人类环状RNA在HCC组织中的表达谱，发现在HCC组织中显著下调的circRNA:circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135),可以作为致癌miR-9的海绵，与HCC患者预后不良密切相关。在细胞质中，circMTO1结合miR-9可以上调p21的表达，抑制HCC的进展。p21已被确定为miR-9的肿瘤抑制因子[12]。敲低circMTO1可促进细胞增殖和侵袭，减少细胞凋亡，降低p21 mRNA和蛋白表达，而过表达circMTO1可促进细胞凋亡，上调p21的mRNA和蛋白表达。此外，miR-9过表达对肿瘤细胞的影响与circMTO1沉默类似。通过对miR-9在cric MTO1沉默细胞中的抑制实验发现，miR-9抑制剂可以抑制circMTO1敲低在HCC细胞中的促进作用，证明circ MTO1可以通过circ MTO1/miR-9/p21轴，海绵化miR-9，抑制miR-9致癌作用。此外，circ MTO1的下调抑制了p21和下游CDK2的表达，而侵袭和增殖标志物MMP2和PCNA在体内上调，说明circ MTO1在体内和体外均能抑制HCC的进展[13]。因此，circ MTO1有可能成为肝癌的预后预测指标和治疗靶点。另一项研究[13]分析显示，从SMYD4转录而来的hsa_circ_0004018的下调的环状RNA与血清AFP水平、肿瘤直径、分化程度、BCLC分期和TNM分期相关。结果表明，hsa-circ-0004018具有一个HCC阶段的特异表达。SMYD4被报道为一种潜在的肿瘤抑制因子，参与了肿瘤发生[14]，提示hsa_circ_0004018作为SMYD4的转录本可能参与HCC的发生发展。此外，hsa_circ_0004018的敏感性优于AFP，这意味着hsa_circ_0004018可能在HCC监测中发挥重要作用。进一步的生物信息学预测表明，hsa_circ_0004018含有5个miRNA序列，可能通过与miR-30e-5p/miR-626-MYC相互作用而在肝癌的发生和转移中发挥重要作用。

由于DExH-Box解旋酶9(DHX9)的调节，HCC组织中cSMARCA5(hsa_circ_0001445)表达下调，而SMARCA5 mRNA和蛋白表达上调[15]。沉默DHX9可以上调cSMARCA5的表达，说明circRNA的调控依赖于DHX9的解旋酶活性。进一步的实验表明，cSMARCA5可能通过DHX9-cSMARCA5-miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3途径抑制肝癌的生长和转移，发挥抑癌作用;而其亲本基因SMARCA5可能是肿瘤启动子[15]，提示SMARCA5和cSMARCA5水平可能共同作为HCC的生物标志物。

肝脂肪变性参与了HCC疾病的进展。circRNA-0046367是从ncRNA数据库中筛选出来的circRNA，作为miR-34a的内源性调节剂，在诱导的脂肪变性HCC细胞中显著降低。对这些下调的circRNA-0046367失去抑制miR-34/PPARα交互,导致脂质过氧化损伤,从而降低肝脂肪变性。配体依赖性转录因子和PPARα是一个基础脂肪酸代谢。PPARα的下调将减少PPARα介导脂类代谢,导致肝细胞脂肪变性，表明circRNA0046367/miR-34a PPARα轴可能参与脂肪氧化和减少肝脂肪变性诱导HCC。此外，在circRNA-0046366中也观察到同样的结果。

通过分析circRNA测序数据集，筛选出circ C3P1作为HCC中下调最明显的环状RNA之一。通过对临床资料的分析，circ C3P1的表达与TNM分期、肿瘤大小、血管浸润程度呈负相关，分析也表明，circ C3P1表达越高，肝癌患者的生存率越低。进一步研究发现，circ C3P1在体内和体外过表达均能显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，说明circ C3P1可作为肝癌的抑癌因子。此外，circ C3P1可以促进糖异生的关键酶PCK1在HCC中下调，而在HCC中通过海绵作用miR-4641降低PCK1可能导致肝癌的发生。通过沉默PCK1，可以消除circC3P1过表达对HCC细胞的抑制。这些结果表明，circ C3P1/miR-4641/PCK1轴可以调节肝癌的生长和转移，并作为肝癌患者预后的生物标志物。

has_circ_0001649在HCC组织中发现明显下调。沉默has_circ_0001649可导致MMP9、MMP10、MMP13的降低，从而增加HCC的转移，说明has_circ_0001649的下调与HCC的转移和生长呈正相关。进一步分析表明，has_circ_0001649与HCC预后不良有关，可能作为HCC的生物标志物。序列分析显示，has_circ_0001649可能存在海绵吸附或转录调节剂的潜力，含有一个U2辅助因子(U2AF)结合位点、五个真核起始因子4A-III (EIF4A3)结合位点和一个转录本(UPF1)结合位点参与HCC的发生发展。此外，通过生物信息学分析，has_circ_0001649也被认为是miRNA海绵。

circ-ITCH通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制癌症扩散，circ-ITCH在HCC组织中的表达低于癌旁组织，circ-ITCH的高表达与HCC良好的生存率相关[16]。进一步分析表明，circ-ITCH中rs10485505和rs4911154两个单核苷酸多态性位点(SNPs)与HCC风险增加密切相关。这些结果表明circ-ITCH可能具有抑制HCC的作用[16]。

ZKSCAN1是一种锌家族基因，在多种癌症中上调并与肿瘤细胞增殖有关。ZKSCAN1的第2外显子和第3外显子拼接在一起形成了circZKSCAN1的环状RNA (hsa_circ_0001727)，在人肝脏中含量丰富。HCC中ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1均明显下调。ZKSCAN1 mRNA的下调与肿瘤大小有关，而circ ZKSCAN1水平影响肿瘤数量、肝硬化、微血管浸润及肿瘤分级。进一步的实验表明，沉默或过表达RNA分别在体内和体外增强或抑制细胞增殖、迁移和侵袭。上述实验中未观察到相互干扰，这意味着这两种同源的RNA在HCC中可能具有不同的调控特征。RNA-seq支持ZKSCAN1 mRNA调控细胞代谢和circ ZKSCAN1参与肿瘤相关信号通路的假说[17]。因此，ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1可能通过相互作用抑制HCC的代谢、凋亡、增殖和转移，从而发挥HCC抑制剂的作用。

有趣的是,许多作为miRNA海绵的环状RNA也可以被认为是HCC的抑癌因子，如cSMARCA5、circ MTO1、circ C3P1，而有些环状RNA可以作为肿瘤启动子，如has_circ_0005075、circ_100338[24(90)]等。这说明环状RNA在HCC中的作用机制是复杂的。circRNA可以作为肿瘤抑制因子或启动子，与或不与海绵miRNA结合，参与蛋白质的结合，这表明，一个circRNA可能通过不同的途径影响不同的HCC进展，这意味着circRNA有可能成为HCC的生物标志物或治疗靶点。

6 小结与展望

随着研究的推进，circRNA的功能不断被揭示，从错误剪接的副产品到具有重要生物学功能的小分子。与其他ncRNA一样，许多环状RNA被证实参与了HCC的进展。在这篇综述中，我们证明circRNA是一种丰富、稳定、保守、结构多样的ncRNA，在疾病尤其是HCC的调控、预测、诊断和治疗靶点方面具有巨大的潜力。然而，由于circRNA复杂的作用机制，目前我们还不能很清楚的解释circRNA是如何参与HCC的发展的。重要的是，circRNA在细胞中的作用和作用方式也有待发现。此外，circRNA结构的特殊性和技术的不足限制了对circRNA功能的研究[18]。目前，HCC中大多数已鉴定的环状RNA功能为miRNA海绵和/或癌抑制因子或启动子。有研究报道circRNA可以通过直接与关键蛋白结合来调控癌症的发展。且有转化成蛋白质或多肽参与癌症进展的潜力。ciRNA和EIciRNA可以与聚合酶II和U1snRNP相互作用，调节其亲本基因的转录。因此，circRNA是否在转录水平或转录后水平参与HCC的过程，或是否通过直接翻译成蛋白发挥作用仍是一个谜。如果是，circRNA是如何参与这些过程的?如果没有，circRNA是否有其他途径影响HCC?

一项新的研究[19]表明，除了细胞外，外泌体、血液和唾液中也发现了丰富的环状RNA。此外，血清外泌体—环状RNA可能能够区分癌症患者和健康个体，这表明环状RNA可能作为癌症诊断的循环生物标志物。由于外泌体由所有细胞分泌并在血液中循环，circRNA可能会影响外泌体运输远端细胞的方式。一项研究发现，肝癌细胞分泌的外泌体miRNA miR-103可影响肝癌转移，增强血管完整性[20]。作为ncRNA的一员，稳定的环状RNA通过分泌进入血液循环的方式影响肝癌的进展，在潜在的癌症检测中发挥着至关重要的作用，或者直接与癌相关基因相互作用，调控肝癌的关键基因，但目前机制尚不清楚。

因此，环状RNA可能参与疾病发展、组织发育和基因调控，其中一些环状RNA在致癌过程中发挥重要作用[21]。然而，通过少量的整合研究，我们只能得出circRNA参与HCC发展的结论，而不能得出circRNA在HCC发展过程中必须发挥关键作用的结论。可以肯定的是，随着技术的不断发展和研究的不断推进，如RNA测序对ncRNA]等实验技术的不断发展，circRNA在HCC发展中的作用将逐渐显现。因此，开发和使用合适的技术来阐明环状RNA在HCC中的分子机制及其调控机制将是未来研究的重点。