噬菌体及其裂解酶防控家畜细菌性疾病的研究进展

谢平林

(上海交通大学农业与生物学院，上海 闵行 200240)

2017年，我国畜牧生产总产值超过3.2万亿元，其中猪肉产量居世界首位，占比达46.19%，可是未来市场发展并不乐观。目前，畜禽规模化生产对病原菌的防治常常局限于使用消毒剂和抗生素，因其滥用而导致药物残留与耐药菌大量出现的问题十分严重[1]。过去已经得到良好控制的疾病再次对畜禽健康构成严重的威胁，养殖业也遭受了巨大的经济损失[2]。

目前利用有益微生物来防控病原菌的感染日益受到重视。噬菌体是一类能特异性侵袭细菌、支原体、螺旋体和真菌等病原体的病毒，自1915年由英国Twort发现后，就被用于研究细菌感染的防治。噬菌体个体微小，在地球上分布广泛且种类丰富。人们普遍认为噬菌体既对植物、动物和人类无害和无耐药性，也不会污染环境，安全性高[3]。噬菌体裂解酶最早于20世纪50年代得到确定，与噬菌体仅作用于病原菌一样，裂解酶不会影响动物体细胞，并不影响有益或无害的动物寄生菌。相比抗生素和消毒剂，裂解酶具有更好的特异性，裂解谱又大于噬菌体的，通常认为裂解酶攻击细菌的速度极快，以致细菌很难对其产生抗性[4]。

因此，噬菌体及其裂解酶作为新型的天然抗菌剂和消毒剂具有一定的优势。本文重点介绍噬菌体及其裂解酶在家畜细菌性疾病防控中的相关研究进展，展示噬菌体及其裂解酶在规模化健康生产中良好的应用前景。

1 噬菌体及其裂解酶替代抗生素和化学消毒剂的优势

近年来，为应对消毒剂与抗生素滥用造成的超级细菌出现和动物性食品药物残留等问题，世界多国颁布了相关的法律法规或措施来推动“无抗生素进程”。我国农业农村部于2017年6月颁发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划》。后抗生素时代即将来临，噬菌体及其裂解酶的独特优势正好可以应对抗生素和化学消毒剂所遇到的治疗瓶颈，是首选的替代品。

噬菌体及其裂解酶能有效地感染和裂解其宿主菌，无残留，无耐药性，是天然的生物消毒剂与抗菌剂[5]。与抗生素和化学消毒剂相比，噬菌体及其裂解酶有很多显著的优势[6]：不仅抗菌效果强，不易引起动物源性致病菌产生耐药性，特异性强，副作用少，安全性较高，自我增殖快，筛选周期短，研发成本低，而且种类极为丰富，取材方便，例如每1 mL水中噬菌体的含量可达2×108个[7]。还可针对性地筛选噬菌体与裂解酶用作预防性制剂。但迄今为止，已经被分离和应用的噬菌体数量非常有限。因此，裂解性噬菌体在控制致病菌感染和解决耐药性问题上有较大的开发空间[8]。

饲养环境防疫消毒是控制、预防和消灭畜禽疫病的主要技术手段。噬菌体及其裂解酶是一类生物消毒剂，与物理消毒法和化学消毒法相比，具有独特的优势。化学消毒法虽适用范围广，但存在诸多问题，如稳定性差、刺激性大、腐蚀性较强、易残留污染环境和破坏生态等，而物理消毒法则使用范围窄且清除不彻底。另外，由于物理消毒法与化学消毒法难以消除在环境中形成芽孢和耐药的细菌，极大地限制了其在家畜生产上的应用。噬菌体及其裂解酶凭借其灭菌高效、作用时间长和安全环保等优点[9]，能广泛适用于地面、土壤、水体、空气以及物体表面(如畜禽棚舍、笼具、器械和车辆)等，对饲养环境中致病菌的防控具有重要意义。

动物生产、食品保鲜加工和医学临床等领域不断有一些噬菌体和裂解酶制剂获得应用，由此可见，噬菌体及其裂解酶制剂作为一种理想的致病菌防治途径，其发展前景十分广阔[10]。

2 噬菌体及其裂解酶防治家畜细菌性疾病的相关研究

在家畜的众多细菌性疾病中，最常见且最广泛的疾病是由感染大肠埃希菌引起的疾病。2007年，一种噬菌体已获得美国农业部批准使用，对牛体隐蔽部位进行喷洒和清洗，以减少饲养过程中大肠埃希菌的污染，这为在家畜的细菌性疾病防治中应用噬菌体和裂解酶制剂铺平了道路[11]。

Smith等英国学者开展了利用两种噬菌体及其混合制剂防治牛腹泻性大肠埃希菌病的研究。试验结果表明，口服单一剂量105PFU/mL的噬菌体能有效治愈由大肠埃希菌O9:K30感染引起的初生牛犊腹泻。而给未经清洁的牛舍喷洒102PFU/mL的两种噬菌体混合制剂后，也可起到很好的预防效果[12]。对试验牛犊的微生物检测表明，噬菌体在牛犊小肠内可迅速大量増殖，并高效杀灭大肠埃希菌，使其数量降到几乎无害的范围。

Smith等还研究了噬菌体对引起羊羔腹泻的大肠埃希菌的控制作用。试验给出生8 h～16 h的羊羔口服感染致病性大肠埃希菌，8 h之后口服1010PFU/mL噬菌体鸡尾酒制剂。检测结果表明，该制剂能显著减少羊羔小肠内大肠埃希菌的数量，并可使腹泻病死率降低28.6%[13]。

Wall等开展了利用多种噬菌体混合制剂控制猪沙门菌感染的研究，试验以口服方式对出栏猪和3～4周龄仔猪接种噬菌体混合制剂。结果显示，口服109PFU/mL混合制剂后，仔猪回肠、盲肠和扁桃体中的沙门菌数减少了99%～99.9%[14]，该制剂还能有效杀灭出栏猪回肠和盲肠中的沙门菌。

猪链球菌病是一直困扰我国养猪业的主要传染病之一，庞亮亮尝试以噬菌体疗法解决这一难题。经小鼠感染模型试验证实，噬菌体SMP疗法对感染了猪链球菌的小鼠能起到很好的保护效果，这为噬菌体疗法在养殖业中的应用提供了理论基础[15]。

大肠杆菌O157:H7是一种人畜共患的食源性致病菌，反刍动物是其主要宿主与传染源。在反刍动物的饲养过程中，噬菌体疗法可有效控制大肠杆菌O157:H7在反刍动物体内的定植，有效降低该致病菌进入食物链的风险[16]。Stanford等利用聚合物包裹噬菌体制成微囊，以抵抗外界的酸性环境。经口服噬菌体微囊治疗后，肉牛体内大肠杆菌的数量显著减少[17]。这种新剂型为噬菌体在家畜生产领域的应用和推广奠定了坚实的基础。

乳房炎是危及奶牛生产最常见的细菌性疾病，金黄色葡萄球菌是其主要致病菌。李陇平等发现噬菌体对金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有显著的预防作用[18]。孙利利等利用噬菌体治疗奶牛乳房炎，试验在不使用抗生素的条件下通过乳头管将106PFU/mL的金黄色葡萄球菌噬菌体输入患病奶牛的乳室，经2～5次处理，患病奶牛都可恢复正常的泌乳能力[19]。

当前，噬菌体与裂解酶疗法在防治家畜细菌性疾病方面的效果良好，有着独特优势，但该技术还属于探究阶段，尚不成熟。随着相关研究的深入和分子生物学技术的成熟，上述问题必将得到逐步解决，噬菌体与裂解酶疗法在规模化健康生产中将展示出更加广阔的应用前景。

3 噬菌体及其裂解酶对家畜饲养环境消毒相关研究

目前，我国因传染病死亡的猪占6%～8%，每年造成上百亿的经济损失。饲养环境消毒是对成本和疾病的有效控制，但传统化学消毒剂的不当使用和滥用必然会让消毒剂如抗生素一样出现耐药性细菌，而且更为严重[20]，尤为重要的是对畜禽舍环境的消毒处理基本每周都要进行，微生物的耐药性会显著影响消毒效果[21]，因此急需新型的生物消毒剂。

生物膜很容易生成并覆盖在畜禽舍笼具、运输车辆、器械及料槽等物体表面，会导致长期的污染问题。据研究，协同使用李斯特菌噬菌体和季铵盐化合物能有效降低不锈钢与聚丙烯表面李斯特菌的数量。有研究发现在水凝胶导管模型(铜绿假单和表皮葡萄球菌生物膜)上喷洒3种噬菌体的混合制剂，能显著减少模型表面生物膜的生成与再生[22]。由此可见，利用噬菌体及其裂解酶对饲养设施及器械的预处理可有效提高安全性。

国内外众多动物试验已经证实，噬菌体鸡尾酒制剂可高效杀灭环境中和动物体内的大肠杆菌，从而有效控制大肠杆菌感染[23]。徐焰等进行了噬菌体XY杀灭环境水样内大肠埃希氏菌效果的试验[24]，消毒效果十分显著。

综上所述，作为一种新型的生物消毒剂，噬菌体、裂解酶或其混合制剂(鸡尾酒法)可有效抑制和杀灭空气中和各种材质表面上的致病菌，可满足不同家畜生产环境的消毒需求。

4 噬菌体及其裂解酶治疗研究趋势

筛选裂解性强的噬菌体(如宿主谱广，吸附速度快，繁殖速率高)，纯化用于治疗。由于噬菌体的特异性，不能满足多重感染的治疗，将多种病原菌的特异噬菌体混合制备成噬菌体“鸡尾酒”制剂，或者联合应用抗生素与噬菌体，可拓宽裂菌谱。鉴于噬菌体治疗存在的局限性如受机体免疫系统影响及特异性强，通过分子生物学手段重建噬菌体是噬菌体疗法研究的核心事项。目前，随着噬菌体表面展示技术日益成熟和应用普遍，在特异性抗体的表达、特异性功能蛋白的制备以及基因工程载体的修饰等方面不断显示出其各种优势。此类分子克隆方法可结合噬菌体疗法在防控多种家畜疫病方面发挥更好的免疫和治疗作用。

裂解酶作为一种新型的抗菌药剂，越来越多的经原核表达方法纯化的裂解酶被用于治疗细菌性疾病，尤其是对常规方法或传统方法难以防控的耐药菌研发其高效的噬菌体裂解酶具有更加重要的现实意义。裂解酶对宿主细菌作用迅速，通过基因工程技术可以产生大量的酶，比噬菌体有更宽的裂解谱，具有更广的应用前景。对裂解酶进行设计、改造与修饰等基因工程技术可解决裂解酶存在的某些不足。连接不同裂解酶的结合域与催化域，产生嵌合体裂解酶。该类裂解酶不仅有较广的裂解谱，较高的灭菌活性，还能在不同pH环境中杀灭病原菌。此外，裂解酶还可和乙二胺四乙酸、柠檬酸和抗生素等联合作用。上述方法不但拓宽了其裂解谱，而且提高了其裂解活性，使之成为解决耐药性难题的有效途径。

在蛋白质工程和基因重组等生物技术发展迅速的今天，越来越多的科学家和企业家都深信在不久的将来，这一领域会不断出现新的成果，并将迎来噬菌体及其裂解酶防控家畜细菌性疾病的新阶段。