糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟的研究进展

吴燕妮，张 琪

0引言

糖尿病是影响全身的代谢性疾病，目前全世界有4.15亿人患有糖尿病，并且它的患病率将持续上升[1]。糖尿病因其导致的各器官慢性并发症而严重损害人们的健康及生活质量，涉及周围神经、大血管、微循环、肾脏、视网膜等多系统损害。近年来，糖尿病眼表病变也日渐引起人们重视，包括干眼、角膜神经病变、角膜上皮损伤愈合延迟等。研究表明糖尿病患者角膜上皮损伤愈合较正常人明显延迟[2]，持续不愈合的角膜损伤可导致复发性上皮糜烂、角膜溃疡甚至角膜穿孔，往往影响糖尿病眼病术后康复进程且治疗棘手，严重影响患者的视觉质量和视功能，也日益引起眼科医生的关注。本文就糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟的病理基础、发病机制及相关治疗的最新进展做一综述。

1糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟的病理基础

角膜上皮损伤修复过程包括角膜缘干细胞增殖、分化、迁移至上皮损伤处，细胞外基质重建等[3]，糖尿病患者角膜上皮细胞结构和功能的改变，上皮层黏附结构受损等情况，可能与糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟密切相关。研究发现，与正常人相比，糖尿病患者角膜上皮细胞层数变少，基底层细胞退化、凋亡，微绒毛数量减少、水肿，细胞间隙增大，出现裂缝，细胞间连接疏松；上皮层基底膜脆性增加、退化[4-5]。基底膜增厚，脆性增加导致上皮细胞容易脱落，从而增加角膜上皮损伤修复难度。对于糖尿病患者，这些角膜上皮结构的改变有助于深入研究糖尿病角膜上皮愈合延迟的机制及治疗。

2糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟的发病机制

2.1高血糖的作用长期的高血糖环境首先对角膜上皮细胞产生直接而快速的损伤，导致其功能减退。其次糖尿病患者体内蛋白质糖基化反应活跃，糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)长期聚集，其导致角膜上皮损伤愈合延迟的机制如下：(1)体内高血糖状态时，大量沉积于角膜上皮细胞和基底膜间的AGEs直接破坏基底膜及细胞黏附结构的功能，减少细胞间的黏附作用及扩展；(2)AGEs与其受体(RAGE)结合促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，ROS可以直接损伤角膜上皮细胞，导致细胞凋亡，还可通过激活JNK和p38 MAPK通路诱导角膜上皮细胞的凋亡[6-7]。另一方面活性氧抑制角膜上皮细胞迁移，破坏细胞膜上的蛋白、脂质以及细胞间黏附结构[8]。

2.2蛋白酶的作用糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟与角膜基底膜脆性增加，细胞间黏附结构减少相关，研究发现部分蛋白酶(protease)参与了以上过程的发生发展。这些蛋白酶通过水解组成基底膜、细胞外基质的层粘连蛋白以及整合素，对上皮基底膜及细胞间黏附结构进行降解，最终导致基底膜脆性增加，细胞间黏附作用减弱，上皮细胞脱落，角膜上皮损伤修复困难，愈合延迟等[9]。目前研究最多的是基质金属蛋白酶-10(matrix metalloproteinase-10，MMP-10)和组织蛋白F(CF)，二者在糖尿病患者角膜中显著升高，通过降解上皮基底膜及细胞间黏附结构导致角膜损伤愈合延迟[10]。另外研究发现这两种蛋白酶也有可能参与细胞内信号通路，MMP-10和CF可能通过作用于整合素，使其与相关生长因子受体结合，抑制相关通路的活化，例如整合素a3b1,可与表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)结合，抑制EGFR/Akt通路，而EGFR/Akt通路是刺激角膜上皮损伤愈合的信号通路[11]。

2.3泪膜的改变泪膜由泪腺分泌，自内向外分为黏蛋白层、水液层、脂质层，对于眼表的保护、细胞再生、润滑角膜结膜、伤口愈合具有重要作用。正常人稳定的泪膜中富含抗氧化剂，如维生素C、维生素E等可保护眼表免受自由基等的攻击以维持角膜上皮细胞的完整性[12]，糖尿病患者泪膜不稳定，角膜上皮失去屏障保护，遭受氧化应激中自由基的攻击；另外糖尿病患者泪液成分中多了几种正常人泪液中未曾发现的蛋白，这可能也与眼表病变具有相关性[13]。泪膜和上皮病变相互作用，当上皮细胞发生病变和缺失，又可影响泪膜的功能，从而形成恶性循环，最终发生角膜上皮病变，角膜上皮损伤愈合延迟甚至畸形。泪膜的改变提醒我们关注糖尿病患者眼表病变的相互影响。

2.4生长因子和细胞因子相关通路的异常生长因子和细胞因子是涉及角膜损伤修复在内的细胞活动(cell behavior)、组织重塑的重要调控因子，它们的异常表达可导致角膜上皮基底膜改变、细胞黏附减少、上皮层脆性增加、基底下神经损伤等。相关的因子研究如下：(1)胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)对细胞生长及代谢具有重要作用，通过与角膜上皮细胞中的胰岛素受体及IGF受体结合介导上皮细胞的存活、增殖及迁移，从而参与角膜上皮损伤修复过程[14]。对于糖尿病患者，IGF-1与升高的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)结合抑制IGF-1R信号通路的激活，并影响上皮细胞增殖、迁移等活动，从而抑制角膜上皮损伤愈合[15]。(2)EGF通过其受体(EGFR等)激活其细胞通路下游中的蛋白激酶效应器，激活EGFR-PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)/Akt信号通路，这一途径对细胞增殖、迁移至关重要，有研究发现在糖尿病大鼠眼角膜中，EGFR及其信号通路中PI3K、Akt等信号分子表达减少与糖尿病大鼠角膜上皮损伤愈合延迟相关，部分学者认为高糖诱导的氧化应激抑制EGFR信号通路、PI3K/Akt通路，导致糖尿病角膜上皮创伤愈合受损[16]。(3)IL-1β/IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)失衡：角膜上皮损伤时，上皮细胞产生较多IL-1β通过与IL-1R结合来激活下游因子抑制上皮损伤愈合。正常人群中，上皮损伤还可以产生IL-1Ra，拮抗IL-1R的生物活性，促进中性粒细胞、NK细胞的浸润，促进上皮损伤愈合；糖尿病大鼠角膜损伤后，上皮细胞产生IL-1β不变，IL-1Ra的表达被抑制，IL-1β/IL-1Ra比值增高，上皮细胞增殖减少，凋亡增加，上皮损伤愈合受损。当加入外源性IL-1Ra后，糖尿病小鼠角膜上皮修复加快[17]。其他因子：阿片类生长因子(opioid growth factor，OGF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)等也逐渐被纳入研究中[18]。这些生长因子和细胞因子的研究对于糖尿病患者角膜上皮愈合延迟的治疗有着重要意义。

2.5角膜神经的改变角膜神经多数来源于三叉神经眼分支，与上皮细胞通过互相释放可溶性营养物质提供营养支持。体外共培养显示三叉神经原细胞释放神经递质和神经肽刺激上皮细胞生长、增殖、分化和胶原蛋白的产生；同时，角膜上皮细胞分泌生长因子(NGF、CNTF、EGF等)促进神经突的形成、延长和存活[19]。糖尿病患者角膜神经纤维释放的可溶性营养物质减少，维持上皮完整性的营养支持不足；而当角膜上皮受到损伤时，又可以影响神经的延长、存活，这种恶性循环导致角膜上皮的营养支持受到严重影响，引起角膜上皮细胞肿胀、形状不规则、排列紊乱，易脱落，基底膜异常，细胞间黏附结构破坏，上皮损伤修复困难。另一方面，糖尿病患者角膜神经纤维主干密度、角膜神经纤维长度、角膜神经分支密度降低，角膜神经弯曲度增加[20]，角膜神经损伤可能导致角膜知觉减退，影响眨眼反射，导致泪膜的不均匀分布，引起干眼症、上皮修复功能受损等[21]。

2.6 microRNA的作用microRNA是短链非编码的寡核苷酸,具有强大的调控作用，影响广泛生物活动，并且这些作用多为负性调控，它们通过与相应的mRNA结合，阻止基因在转录后水平产生相应蛋白质[22]。多项研究证实它们在细胞的增殖、分化、迁移、凋亡中具有重要作用[3]。近年来，学者们发现了miRNA在糖尿病患者角膜上的差异性表达，并且对于其作用有了更多认识。Winkler等[23]发现miR-146a在糖尿病患者角膜缘细胞的表达高于正常人，miR-146a通过抑制角膜上皮细胞损伤愈合通路中的信号分子p38、EGFR的磷酸化，影响角膜上皮细胞移行，延迟上皮损伤愈合。miR-204-5p高表达于糖尿病小鼠的角膜中，抑制其下游基因SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog-1)通过蛋白质的去乙酰化调控细胞的存活、发育、代谢和细胞周期。糖尿病患者角膜中SIRT1的表达减少，提高SIRT1的表达可促进糖尿病角膜上皮损伤的修复，使角膜上皮细胞周期阻滞，增殖发育受损，修复功能减退。给糖尿病小鼠结膜下注射miR-204-5p抑制剂可促进SIRT1和cyclin D1上调来加速创面愈合[24]。miR-424、miR-182等异常表达也与角膜上皮细胞损伤愈合延迟相关。虽然糖尿病眼角膜miRNA变化的研究刚开始，相关机制仍需进一步探索[25]，但对于糖尿病眼角膜miRNA的研究也为我们对于糖尿病角膜上皮愈合延迟的研究打开了新的思路。

3糖尿病患者角膜上皮损伤愈合延迟的治疗

糖尿病发病率持续上升，其并发症尤其是糖尿病角膜上皮损伤愈合延迟的诊疗仍是一项挑战，目前临床上常规治疗方法包括人工泪液润眼、角膜接触镜，更严重者可行睑裂缝合术[26]，但这些方法只是为角膜再上皮化提供一个良好环境，并不能从根本上加速角膜上皮化，因此如何加快角膜修复速度已被提上日程，越来越多的学者已加入到当前的探讨中。

3.1抗氧化应激治疗氧化应激是引起糖尿病角膜上皮病变的一个重要因素，ROS直接或间接损伤角膜上皮细胞及细胞间黏附结构引起角膜上皮损伤愈合延迟[7]，相关治疗思路如下：有学者发现局部使用消退素d1(resolvin D1，RvD1)促进糖尿病角膜上皮修复的机制主要是通过抑制AGEs途径中相关氧化酶的活性减少ROS，并且RvD1的应用可重新激活氧化应激反应性转录因子Nrf2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2)及其下游受损的抗氧化基因的表达[27]。另外P物质(substance P，SP)通过作用于NK-1受体促进ROS的清除以缓解高血糖对角膜上皮的损伤[28]。

3.2胰岛素治疗胰岛素主要用于控制血糖及糖尿病相关并发症，随着对糖尿病并发症认识的加深，人们开始关注胰岛素在眼部并发症方面的应用。2007年就有学者提出局部使用胰岛素可加快糖尿病小鼠角膜创面的愈合[29]，随着研究深入，研究者发现胰岛素滴眼液可以防止角膜基底神经纤维的丢失[30]，促进角膜上皮昼夜节律性改变的恢复，这可能是胰岛素促进角膜上皮修复的机制[31]。在临床研究中，术前使用胰岛素眼液可加快患者玻璃体切除术术后角膜上皮愈合速度[32]。但需要注意的是胰岛素并不能促进正常角膜损伤的愈合，高糖培养的角膜即使处于高浓度胰岛素中，角膜伤口愈合速度仍不及正常角膜[33]。对于胰岛素的应用仍需更多试验进行探讨，但其前景是可观的。

3.3生长因子及神经保护因子治疗糖尿病角膜上皮损伤愈合延迟与角膜神经改变及生长因子关系密切。NGF因其抗凋亡、抑制炎症的作用促进糖尿病角膜上皮修复[34-35]。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是具有神经保护作用的细胞因子，一方面它可以通过激活STAT3刺激角膜上皮干细胞的有丝分裂，另一方面可以促进角膜神经再生，减轻角膜神经病变，从而加速角膜上皮修复[36]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)联合二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)促进角膜上皮创面愈合。目前较公认的机制主要包括抑制氧化应激，神经营养保护作用以及抑制炎症反应，未来还需要更多的实验去探讨[37]。也有学者提出患者自体血清可促进角膜创面的愈合[38]，目前考虑血清中黏附分子、EGF、TGF-β与这种效果有关，但具体机制并不清楚。尽管我们对相关因子治疗糖尿病角膜上皮损伤愈合延迟的前景看好，但大多数药物的具体使用方案及副作用仍需进一步探讨[39]。

3.4角膜缘干细胞移植角膜上皮细胞由角膜缘干细胞增殖、分化而来，当角膜上皮损伤，一系列的信号通路启动，角膜缘干细胞开始增殖、分化、迁移至上皮损伤处进行修复，糖尿病患者角膜缘干细胞功能障碍，影响角膜上皮的修复[40]。干细胞移植可能成为治疗糖尿病角膜上皮病变严重病例的有效方法。干细胞来源包括捐献者的健康干细胞以及脐带血中提取的造血干细胞(HSC)，在糖尿病大鼠的实验中，注射人HSC可改善角膜上皮修复情况,但其作用机制尚不明了[41]。虽然角膜缘干细胞的移植技术目前并不成熟，但前景可观，未来可能应用于较多因角膜上皮愈合延迟而影响生活质量的糖尿病患者。

3.5基因治疗基因疗法已成功地应用于包括角膜在内的不同组织，当前糖尿病角膜病变研究较多的靶基因主要是MMP-10、组织蛋白F以及C-met，糖尿病患者体内C-met含量下调，MMP-10、组织蛋白F、miRNA(miR-204-5p等)表达过量，病毒转染C-met cDNA以及shRNA沉默MMP-10、组织蛋白F基因与miRNA，从而治疗角膜上皮损伤愈合延迟[25]，基因治疗目前还有许多未解决的问题，包括基因片段的载体病毒可能诱导机体免疫反应等副作用，但总体来说,基因治疗方案极具前景，极有可能恢复糖尿病患者角膜功能，可以考虑是否进一步开发以供将来临床使用。

4小结

糖尿病患者角膜病变尤其上皮损伤愈合延迟是糖尿病眼病患者的常见临床问题，影响术后康复且治疗相对棘手，近年来日益引起人们的关注。目前对于糖尿病患者角膜上皮愈合延迟的发病机制及治疗探索仍处于比较初始的阶段，相信随着对糖尿病角膜上皮损伤机制研究的逐渐深入，以及对相关治疗思路的不断探讨，将有望从源头上治疗糖尿病患者的角膜病变，加快对角膜上皮损伤的修复，提高患者的视觉质量。