脂肪干细胞对绝经后骨质疏松大鼠c-Fos、c-Jun表达的影响

汪玉海，王志斌，张小钰，金丽娟

研究发现随着绝经后女性雌激素的缺乏，女性骨质疏松的发病率明显增加。因此，绝经后女性被认为是发生骨质疏松的高危人群［1-3］。由雌激素缺乏引起骨质疏松的机制尚未完全发现，可能有以下几个方面［4-6］：激活细胞凋亡、抑制细胞增殖并使成骨细胞的数目减少，最终导致骨量丢失。所以，对骨代谢过程进行干预是治疗绝经后骨质疏松的重要途径［7-8］。脂肪干细胞已经被证实能够分化为成骨细胞并用于骨质疏松模型大鼠的治疗，与骨髓间充质干细胞比较，其具有来源丰富、取材简单、获得率高等优势［9-13］，但脂肪干细胞移植用于绝经后骨质疏松大鼠治疗的价值及机制均未明确。研究发现，在成骨细胞分化成熟及增殖的过程中，c-Fos 及c-Jun 是两种关键的调控基因。近年来关于c-Fos 及c-Jun基因在骨代谢及骨转化过程中的研究认为，一方面，c-Fos 及c-Jun 能够直接刺激成骨细胞增殖，与成骨细胞肿瘤的形成密切相关［14］；另一方面，BGP、BALP、I 型胶原等基因的启动子区域存在AP-1 结合位点，c-Fos 及c-Jun 通过AP-1 启动BGP、BALP、I 型胶原的表达并促进骨形成［15-16］。因此，本研究旨在通过双侧卵巢摘除制作骨质疏松大鼠模型，并通过实验研究脂肪干细胞移植对骨质疏松大鼠股骨成骨细胞增殖及c-Fos、c-Jun 表达的影响，为进一步研究脂肪干细胞移植防治骨质疏松提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物：3 月龄健康SD 雌性大鼠，体重（180±20）g，购自宁夏医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（宁）2015-0001。

1.2 实验试剂：大鼠脂肪间充质干细胞（南京科佰生物科技有限公司）液氮内冷冻保存，小牛血清（甘肃民海生物公司），胰蛋白酶（美国SIGMA 公司），骨密度仪（美国GE 公司），DMEM 培养基、胰蛋白酶（Gibco 公司），HE 染色试剂盒（上海碧云天公司），碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（日本Wako 公司），RTPCR 试剂盒与RNA 提取试剂盒（TaKaRa 公司），Worthernblot 增强化学发光试剂盒（PIERCE），兔抗c-fos 抗体、兔抗c-jun 抗体、二抗（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 脂肪干细胞培养及细胞悬液的制备：脂肪干细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 进行贴壁培养，密度生长至90%后用胰蛋白酶消化、1∶3 传代继续培养；收集第4 代脂肪干细胞，用磷酸盐缓冲液调整细胞密度至2×107/mL，按照100 μl/管分装细胞。

1.3.2 实验动物模型的建立及分组

1.3.2.1 绝经后骨质疏松大鼠模型建立：32 只SD雌性大鼠用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔内注射麻醉，取大鼠腹部正中纵行切口逐层切开，找到卵巢丝线结扎后摘除。逐层缝合后，任其自由活动。常规喂养12 周后通过骨密度的测量筛选，取造模成功的26 只大鼠进入实验。

1.3.2.2 假手术组大鼠模型建立：10 只SD 雌性大鼠按照相同的方法麻醉并将卵巢周围脂肪团拉出，仅切除卵巢附近的脂肪组织适量、不摘除卵巢。常规喂养。

1.3.3 脂肪干细胞移植组：将造模成功的20 只大鼠分为脂肪干细胞移植组与骨质疏松模型组，每组10 只。脂肪干细胞移植组将100 μl 细胞密度为2×107/mL的脂肪干细胞悬液通过尾静脉注射注入大鼠体内，每周1 次，连续注射8 周；骨质疏松模型组和假手术组给予生理盐水100 μl 尾静脉注射，每周1 次，连续注射8 周。

1.3.4 指标测定：喂养至第8 周，分别处死3 组大鼠，完整取出股骨，剔除股骨周围肌肉后，行双能X线骨密度测定；Elisa 试剂盒检测血清指标：经腹主动脉采集血液约3 mL，静置0.5 h 后3 000 转/min，离心10 min，取血清并采用ELISA（酶联免疫吸附实验）试剂盒检测骨碱性磷酸酶（BALP）、骨钙素（BGP）、总I 型胶原氨基端延长肽（PINP）、血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRAP-5b）的含量。使用RT-PCR 和Western blot 技 术检测OPG、RANKL、c-Fos、c-Jun表达量；取右侧股骨，采用RIPA 裂解液提取蛋白；采用BCA 试剂盒测定蛋白含量后取30 μg 蛋白样本与上样缓冲液混合，加入预先配置好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶点样槽内，进行电泳、转膜后用5%脱脂牛奶在室温封闭NC 膜2 h，用OPG、RANKL、c-Fos、c-Jun、β-actin 的第一抗体在4 ℃下孵育NC 膜过夜；第2 天，在室温孵育第二抗体2 h，加入ECL 显影液并在化学显影仪中曝光得到蛋白条带，根据条带灰度值以β-actin 为内参，计算OPG、RANKL、c-Fos、c-Jun 的表达量。

1.4 统计学方法：采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以±s 表示，3 组间比较采用方差分析，两两比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪干细胞的形态及鉴定：脂肪干细胞接种后24 h，少量细胞贴壁生长，细胞外形呈短梭形或多角形；接种后7 d 大量细胞贴壁生长并发生融合，细胞外形呈典型的纤维样细胞、长梭形，见图1-图2（目录后）。

经流式细胞仪检测，脂肪干细胞中干细胞标志物CD29、CD105的阳性表达均在90%以上，内皮标志物CD31及造血标志物CD45阳性表达均在5%以下，符合脂肪干细胞的免疫表型。

2.2 各组大鼠骨组织中矿物质盐含量及OPG、RANKL 表达的比较：与假手术组比较，骨质疏松组大鼠左侧股骨中矿物质盐的含量及右侧股骨中OPG 的表达量明显降低，RANKL 的表达量明显增加（P＜0.05）；与骨质疏松组比较，脂肪干细胞组大鼠左侧股骨中矿物质盐的含量及右侧股骨中OPG 的表达量明显增加，RANKL 的表达量明显降低（P＜0.05），见图3（目录后）。

2.3 各组大鼠血清骨代谢指标的比较：与假手术组比较，骨质疏松组大鼠血清中BALP、BGP、PINP 的含量明显降低，TRAP－5b 的含量明显增加（P ＜0.05）；与骨质疏松组比较，脂肪干细胞组大鼠血清中BALP、BGP、PINP 的含量明显增加，TRAP－5b 的含量明显降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清中BALP、BGP、PINP、TRAP-5b 含量的比较（±s）

表1 各组大鼠血清中BALP、BGP、PINP、TRAP-5b 含量的比较（±s）

注：*与假手术组比较，P＜0.05；＃与骨质疏松模型组比较，P＜0.05。

2.4 各组大鼠骨组织中c-Fos、c-Jun 表达的比较：与假手术组比较，骨质疏松组大鼠右侧股骨中c-Fos、c-Jun 的表达量明显降低（P＜0.05）；与骨质疏松组比较，脂肪干细胞组大鼠右侧股骨中c-Fos、c-Jun 的表达量明显增加（P＜0.05），见表2 及图4（目录后）。

表2 各组大鼠右侧股骨中c-fos、c-jun 表达的比较（±s）

表2 各组大鼠右侧股骨中c-fos、c-jun 表达的比较（±s）

注：*与假手术组比较，P＜0.05；＃与骨质疏松模型组比较，P＜0.05。

3 讨论

骨质疏松发生的根本原因是成骨细胞与破骨细胞之间的平衡被打破。由于干细胞具备向成骨细胞分化的潜能，移植进入机体内的干细胞向成骨细胞分化后能够纠正成骨细胞与破骨细胞失衡的状态，因此干细胞能够用于骨质疏松的治疗。干细胞一方面可以直接增加成骨细胞数目，促进骨形成过程中的胶原合成、骨质矿化［17］；I 型胶原是骨基质内主要的胶原蛋白，在成骨细胞大量合成I 型胶原的过程中副产物PINP 也大 量生成［18］；BGP 是骨基质内主要的非胶原成分，成骨细胞分泌的BALP 参与矿化过程并增加BGP 的合成［19］。干细胞另一方面通过成骨细胞分泌的OPG 与RANKL 竞争性结合破骨细胞表面的受体RANK，抑制RANKL/RANK 对破骨细胞的活化及破骨细胞介导的骨吸收，进而有利于增加骨密度，减少骨吸收副产物TRAP-5b 的生成［20-21］。在本研究中，骨质疏松模型大鼠骨组织中OPG 的表达、矿物质盐的含量及血清中BALP、BGP、PINP 含量明显降低，骨组织中RANKL 表达及血清中TRAP-5b的含量明显增加，符合骨质疏松发生过程中的骨代谢特征；在移植脂肪干细胞后，骨质疏松大鼠骨组织中OPG 表达、矿物质盐及血清中BALP、BGP、PINP 的含量明显增加，骨组织中RANKL 表达及血清中TRAP-5b 的含量明显减少，说明脂肪干细胞对绝经后骨质疏松模型大鼠的骨代谢具有改善作用，这可能与脂肪干细胞向成骨细胞的分化成熟有关，也与脂肪干细胞增加骨密度、改善骨形态的作用吻合。

在成骨细胞分化成熟及增殖的过程中，c-Fos及c-Jun 是两种关键的调控基因。最早的研究认为，c-Fos 及c-Jun 基因是两种即刻早期基因，参与转录因子AP-1 的组成并在细胞增殖、分化、发育的调控中起着重要作用。近年来关于c-Fos 及c-Jun 基因在骨代谢及骨转化过程中的研究认为，一方面，c-Fos及c-Jun 能够直接相关［19］；另一方面，BGP、BALP、I型胶原等基因的启动子区域存在AP-1 结合位点，c-Fos 及c-Jun 通过AP-1 启动BGP、BALP、I 型胶原的表达并促进骨形成［20-21］。本研究对c-Fos 及c-Jun 表达的分析结果显示，骨质疏松模型大鼠骨组织中c-Fos 及c-Jun 的表达明显减少，脂肪干细胞移植后骨质疏松大鼠模型中c-Fos 及c-Jun 的表达明显增多，说明增加c-Fos 及c-Jun 的表达可能是脂肪干细胞移植增加骨密度、改善骨形态、调节骨代谢的机制，未来可通过c-Fos 及c-Jun 靶向敲除的动物来验证两种基因在脂肪干细胞移植治疗绝经后骨质疏松中的价值。

综上所述，脂肪干细胞移植能够改善绝经后骨质疏松大鼠的骨密度、骨形态、骨代谢并增加c-Fos、c-Jun 的表达，为未来脂肪干细胞移植治疗绝经后骨质疏松提供实验依据。但如何将其应用于临床骨质疏松患者的治疗，仍有许多重要的问题需要更进一步的研究。