Pyk2促进血管紧张素II诱导的大鼠心肌细胞肥大

鄢 雯，刘立新，孔祥照，骆雨辰，李中秋，李 囡

(首都医科大学 燕京医学院， 北京 101300)

心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心脏适应血流动力超负荷的一种代偿反应。病理性心肌肥大是引起心血管疾病发生的一种重要的独立危险因素，持续性的心肌肥大失代偿后将导致心肌收缩力减退和心力衰竭[1-2]，严重危害人体健康，探讨其发生机制具有重要意义。Pyk2(proline-rich tyrosine kinase-2)，即黏着斑激酶家族新成员，是一种富含脯氨酸的酪氨酸激酶，在细胞内信号传导中占有重要地位，活化的Pyk2能参与ROS产生、凋亡信号传导和心肌细胞死亡等过程[3]。有报道Pyk2在神经细胞缺血损伤和心血管疾病的发生发展中都发挥重要作用[4-5]。本研究主要探讨Pyk2对Ang Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：出生3 d内的SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001]。

1.1.2 试剂：血管紧张素II(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ), anti-PYK2(phospho Y402)antibody和anti-PYK2 antibody(Abcam公司)；PF-431396(Pyk2抑制剂)(Selleck公司)；p53 antibody和GAPDH antibody(南京恩晶生物科技有限公司)；FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术公司)；Trizol总RNA抽提试剂(Sigma-Aldrich公司)；SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)；GoScriptTM反转录系统(Promega公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo Fisher公司)；免疫化学发光HRP底物(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验的分组及处理：常规提取大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为4组：对照组、Ang Ⅱ诱导组、PF-431396组及PF-431396干预Ang Ⅱ诱导组。其中对照组的心肌细胞给予DMEM培养；Ang Ⅱ诱导组的心肌细胞在DMEM培养条件下，给予终浓度为100 nmol/L的Ang Ⅱ刺激24 h；PF-431396组的心肌细胞在DMEM培养条件下，给予终浓度为10 μmol/L的PF-431396，在Ang Ⅱ刺激前30 min加入；PF-431396干预Ang Ⅱ诱导组的心肌细胞在DMEM培养条件下，给予终浓度为100 nmol/L的Ang Ⅱ刺激24 h，在Ang Ⅱ刺激前30 min，加入终浓度为10 μmol/L的PF-431396。

1.2.2 细胞骨架蛋白(α-actinnin)染色检测心肌细胞肥大：4%多聚甲醛固定细胞爬片，室温30 min，1×PBS冲洗，5 min/3次；封闭通透室温30 min，1×PBS冲洗，5 min/3次；滴加α-actinnin一抗(10～20 μg/mL)，4 ℃摇床过夜；隔天从4 ℃取出复温20 min，1×PBS冲洗，5 min/3次；加二抗室温孵育1 h，1×PBS冲洗，5 min/3次；滴加DAPI染核5 min，1×PBS冲洗，5 min/3次；蒸馏水、75%、95%、和100%乙醇各10 s；碘化钠甘油封片。

1.2.3 RT-qPCR检测肥大指标的mRNA：mRNA提取、定量和反转实验方法见文献[10]。引物的设计及合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成(表1)。

1.2.4 Western blot检测心肌细胞中p-Pyk2、Pyk2及p53蛋白表达：提取心肌细胞总蛋白并测定蛋白浓度，将蛋白样品变性上样，进行电泳和电转。封闭液室温封闭30 min，稀释一抗， 4 ℃摇床孵育过夜，稀释二抗，室温摇床缓慢孵育1 h，利用化学发光仪进行蛋白条带检测。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Ang Ⅱ上调心肌细胞p-Pyk2表达

Ang Ⅱ组心肌细胞中p-Pyk2蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05)(图1)。

2.2 PF-431396抑制心肌肥大

与对照组相比，Ang Ⅱ组的心肌细胞表面积明显增大(P<0.05)，PF-431396干预组表面积明显减小(P<0.05)(图2A)。

Ang Ⅱ组的肥大指标的mRNA表达明显升高(P<0.05)，PF-431396明显降低肥大指标的mRNA水平(P<0.05)(图2B)。

2.3 PF-431396降低p-Pyk2和p53的蛋白水平

心肌细胞经Ang Ⅱ刺激后，p-Pyk2和p53蛋白水平较对照组升高(P<0.05)，PF-431396明显降低其表达(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group图1 Ang Ⅱ刺激下p-Pyk2的蛋白表达增加Fig 1 Ang Ⅱ increased the protein expression of p-Pyk2 compared with

A.size of cardiomyocytes was detected by α-actinin fluorescence staining; B.mRNA level of hypertrophic markers (ANP and β-MHC) was detected by RT-qPCR; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang Ⅱ group图2 Pyk2抑制剂PF-431396对心肌肥大指标的影响Fig 2 Effect of Pyk2 inhibitor PF-431396 on the level of cardiac

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang Ⅱ group图3 加入PF-431396后 p-Pyk2和p53蛋白表达水平Fig 3 Protein levels of p-Pyk2 and p53 after adding

3 讨论

Pyk2作为一种酪氨酸蛋白激酶，是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)家族的新成员，在许多细胞中都可表达[6]，并参与细胞增殖、分化以及某些疾病的发生发展。Pyk2可被一系列因子激活，如生长因子、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、G蛋白耦联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)、Ang Ⅱ以及缓激肽等。体外培养幼年及成年鼠心肌细胞中，Pyk2可被ET-1迅速激活[7]。在压力负荷导致的左室肥厚模型中，Pyk2被激活并发挥重要作用；在心脏移植手术失败的心脏中，Pyk2的表达和活性也显著增加[8]。

Ang Ⅱ通过与血管紧张素Ⅱ 1型受体 (angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R) 结合调节心肌的正性变力、变时作用及心肌细胞的生长，参与调控心血管系统的功能和疾病的发生[9-10]。本结果显示，Ang Ⅱ可明显上调肥大心肌细胞中p-Pyk2的蛋白水平，提示Ang Ⅱ激活Pyk2。PF-431396作为Pyk2的一种有效抑制剂参与疾病的发展。PF-431396通过抑制Pyk2/MCU通路阻止Ca2+超载、线粒体损伤及细胞死亡[5]。本实验发现PF-431396可使p-Pyk2的蛋白水平明显降低，心肌肥大指标也明显改善，包括心肌细胞表面积减小，肥大指标的mRNA水平也明显降低，提示Pyk2的激活参与Ang Ⅱ诱导心肌肥大的发生。

Pyk2在肾脏组织中能被Ang Ⅱ激活，并通过介导相关信号通路发挥一定作用[11]。肿瘤抑制基因p53，通过诱导细胞周期停滞和凋亡，达到抑制细胞增值的作用，在心肌肥大中也发挥重要的调节作用。Ang Ⅱ可通过抑癌基因p53，参与调节心肌细胞肥大过程[12-13]。p53与Pyk2存在一定联系，在许多疾病发生发展过程中发挥重要作用[14]。为了明确Pyk2在Ang Ⅱ诱导下心肌细胞内的信号传导机制，本研究检测了Ang Ⅱ诱导下肿瘤抑制基因p53的蛋白表达，发现p53的蛋白水平明显升高，而加入PF-431396后，表达明显降低。

综上所述，富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)可通过调控肿瘤抑制基因p53的表达，促进Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，这将为临床心肌肥大的治疗提供一个新的潜在靶点。