奥沙利铂联合柔红霉素诱导结肠癌细胞系HT-29凋亡

田春阳， 刘晓政，范军朝

(1.南阳市中心医院 消化内科, 河南 南阳 473000； 2.河南大学第一附属医院 麻醉科， 河南 郑州 475000)

奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)和柔红霉素(daunorubicin,DNR)能够抑制结肠癌细胞的恶性表型，而对于二者联合对结肠癌细胞的作用及机制尚不明确[1-2]。第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)具有双重抑制肿瘤作用，其可以降低细胞中蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的磷酸化水平[3]。柔红霉素能够上调白血病细胞系中PTEN的表达，奥沙利铂能够提高三阴乳腺癌患者中PTEN表达水平[4-5]。本实验探讨奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞凋亡的影响及机制，为提高结肠癌患者的生存率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)；柔红霉素(山东新时代药业股份有限公司)；活化的caspase-3(cleaved caspase-3)抗体、Akt抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；磷酸化的Akt(p-Akt)抗体、PTEN抗体(Santa Cruz公司)；MTT(上海华舜生物工程有限公司)；结肠癌细胞系HT-29(上海奥陆生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:将HT-29细胞分成4组，对照组(不做处理)、OXA组(40 mg/L的奥沙利铂处理)、DNR组(0.23 μmol/L的柔红霉素处理)、联合组(0.23 μmol/L的柔红霉素和40 mg/L的奥沙利铂处理)。

1.2.2 MTT法检测结肠癌细胞增殖:将HT-29细胞接种到96孔细胞培养板中，分别用MTT法检测0、10、20、40、80 mg/L奥沙利铂和0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L柔红霉素处理后细胞存活率。

1.2.3 平板克隆实验检测结肠癌细胞克隆形成能力: 培养HT-29细胞至第14天时，出现肉眼可见的细胞克隆。在显微镜下计数观察大于50个细胞的克隆数目。

1.2.4 流式细胞计量术检测结肠癌细胞凋亡:继续培养HT-29细胞2 d以后，annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡。

1.2.5 Western blot检测结肠癌细胞中cleaved caspase-3和PTEN、Akt、p-Akt蛋白表达:继续培养HT-29细胞2 d以后，提取蛋白。常规SDS-PAGE电泳。电转膜，Image J分析各个条带的吸光度值，GAPDH作为参照，分析目的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 奥沙利铂和柔红霉素对结肠癌细胞HT-29增殖影响

不同浓度的柔红霉素处理后的结肠癌细胞HT-29的存活率均明显下调，计算柔红霉素的半数抑制浓度为(0.23±0.04)μmol/L(表1)。不同浓度的奥沙利铂处理后的结肠癌细胞的存活率也降低，计算奥沙利铂半数抑制浓度为(37.59±4.56) mg/L(表2)。后续实验选用0.23 μmol/L柔红霉素和40 mg/L奥沙利铂处理结肠癌细胞。

表1 柔红霉素处理后结肠癌细胞HT-29存活率Table 1 Survival rate of colon cancer cells HT-29

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

表2 奥沙利铂处理后结肠癌细胞HT-29存活率Table 2 Survival rate of colon cancer cells HT-29

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

2.2 奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29增殖和克隆形成能力影响

柔红霉素、奥沙利铂和奥沙利铂联合柔红霉素处理后的结肠癌细胞HT-29的存活率降低，细胞克隆形成数目也减少，并且奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29增殖抑制和克隆形成抑制作用更强(P<0.05)(图1，表3)。

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with DNR and OXA图1 奥沙利铂联合柔红霉素处理后结肠癌细胞HT-29克隆形成数目比较Fig 1 Comparison of colony formation of colon cancer cells HT-29 after treatment with oxaliplatin combined with daunorubicin

表3 奥沙利铂联合柔红霉素处理后结肠癌细胞HT-29存活率和克隆形成数目Table 3 Survival rate and colony number of colon cancer cells HT-29 after treatment with oxaliplatin

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with DNR and OXA.

2.3 奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29凋亡影响

柔红霉素、奥沙利铂和奥沙利铂联合柔红霉素处理后的结肠癌细胞HT-29的凋亡率均升高，细胞中cleaved caspase-3蛋白水平也升高，并且奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29凋亡诱导和cleaved caspase-3蛋白表达促进作用更强(P<0.05)(图2，表4)。

A.flow cytometry was used to detect the effect of oxaliplatin combined with daunorubicin on colon cancer cell apoptosis; B.Western blot was used to detect the effect of oxaliplatin combined with daunorubicin on the expression of cleaved caspase-3 protein in colon cancer cells图2 奥沙利铂联合柔红霉素诱导结肠癌细胞HT-29凋亡Fig 2 Oxaliplatin combined with daunorubicin induces apoptosis in colon cancer cells HT-29

表4 奥沙利铂联合柔红霉素处理后结肠癌细胞HT-29凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平Table 4 Apoptosis rate and cleaved caspase-3 protein level in colon cancer cells HT-29 treated with oxaliplatin combined with daunorubicin

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with DNR and OXA.

2.4 奥沙利铂联合柔红霉素对结直肠癌细胞HT-29中PTEN、Akt、p-Akt蛋白表达影响

柔红霉素、奥沙利铂和奥沙利铂联合柔红霉素处理后的结肠癌细胞HT-29中PTEN蛋白水平升高，p-Akt蛋白水平降低，并且奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29中PTEN表达促进和p-Akt表达抑制作用更强(P<0.05)(图3，表5)。

图3 Western blot检测奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29中PTEN、Akt、p-Akt蛋白水平影响Fig 3 Western blot analysis of the effects of oxaliplatin combined with daunorubicin on PTEN, Akt, and p-Akt protein levels in colon cancer HT-29 cells

表5 奥沙利铂联合柔红霉素处理后结肠癌细胞中PTEN、Akt、p-Akt蛋白水平Table 5 PTEN, Akt, p-Akt protein levels in colon cancer cells treated with oxaliplatin combined

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with DNR and OXA.

3 讨论

铂类药物目前已经成为结直肠癌、卵巢癌等多种实体瘤的基础化疗药物[6]。在结肠癌细胞中的研究表明， 奥沙利铂诱导肿瘤细胞凋亡的同时可以促进细胞中caspase凋亡反应的活化，奥沙利铂还可以联合沉默受体相互作用蛋白激酶1、过表达PTEN等发挥抗肿瘤作用[7]。本实验的结果表明， 奥沙利铂能够通过caspase级联反应诱导结肠癌细胞HT-29凋亡发生。在肝癌、结肠癌等肿瘤细胞中的研究显示，柔红霉素不仅可以抑制癌细胞的增殖还具有诱导癌细胞凋亡的作用[8]。研究显示，二甲双胍等都能够协同柔红霉素发挥抑制肿瘤增殖的作用[9]。本实验的结果表明，柔红霉素和奥沙利铂具有协同抗结肠癌细胞的作用。

本实验的结果还显示，无论是单独使用柔红霉素还是单独使用奥沙利铂，结肠癌细胞HT-29中的PTEN表达水平均升高，并且奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞HT-29中PTEN的表达促进作用更强，同时奥沙利铂联合柔红霉素还可以降低细胞中磷酸化Akt表达水平。PTEN是目前公认的抑癌基因，其具有双重特异性磷酸酶活性，PTEN能够降低Akt磷酸化水平，诱导细胞凋亡发生[10]。本实验表明，柔红霉素联合奥沙利铂可以上调PTEN表达并下调p-Akt水平，说明柔红霉素联合奥沙利铂可能通过PTEN/Akt途径发挥诱导结肠癌细胞HT-29凋亡作用。

总而言之，柔红霉素和奥沙利铂具有诱导结肠癌细胞HT-29凋亡的作用，并且二者联合具有协同抗结肠癌细胞HT-29的作用，这为提高结肠癌患者生存期提供了参考依据。