循环肿瘤细胞用于肝细胞癌诊断和预后评估的研究进展▲

朱 鹏 覃 刚 吴莉莉

(四川省遂宁市第一人民医院消化内科，遂宁市 629000，电子邮箱：tougaozhu001@163.com)

【提要】 肝细胞癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，预后较差。肝细胞癌的早期诊断有助于临床早期干预，提高患者生存率。体液活检是近年来较受关注的恶性肿瘤早期筛查诊断方法，其具有无创、准确、可重复的优点。循环肿瘤细胞(CTC)检测属于体液活检技术之一，在肝细胞癌的诊断和预后评估中具有重要的临床价值。本文就CTC在肝细胞癌诊断和预后评估中的应用价值进行综述。

肝细胞癌是临床上十分常见的消化系统恶性肿瘤，在全球范围内其发病率均较高，死亡病例约占恶性肿瘤患者的8%[1]。肝细胞癌的致病机制十分复杂，与慢性肝炎病毒感染、遗传、药物、环境等多因素均有关[2]。在我国，由于慢性乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒感染的广泛流行，每年新发肝细胞癌总数为35万～45万人，约占全球新发肝细胞癌患者的40%，造成了严重的公共卫生负担[3]。肝细胞癌通常起病隐匿，患者确诊时常已处于疾病中晚期，此时缺乏有效的治疗手段，因此临床预后极差。肝细胞癌的早期筛查诊断有助于指导临床进行针对性干预，尤其是采取根治性手术切除，从而改善患者的临床预后[4]。

体液活检是近年来受到广泛关注的恶性肿瘤诊断方法，其主要是通过无创技术检测实体肿瘤或转移病灶释放到外周循环中的肿瘤成分，主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)、循环肿瘤相关DNA及RNA、肿瘤外泌体等[5]。其中CTC检测作为体液活检技术的重要组成部分，在恶性肿瘤患者的诊断、预后及疗效评估等方面具有重要价值。除了美国食品药品监督管理局已批准的CellSearch®系统，目前在改进及研发更为便捷准确的CTC检测技术方面也取得一些进展[6]。大量研究显示，肝细胞癌细胞在疾病早期即可从实体瘤中脱离并进入外周循环而成为CTC，即使在未发生远处转移的情况下，肝细胞癌患者的CTC计数亦可长期处于较高水平，且CTC计数在肝细胞癌的临床诊断及预后评估中具有较高的价值[7-8]。本文就CTC检测应用于肝细胞癌临床诊断及预后评估的研究进展进行综述，为肝细胞癌的临床诊断及预后评估提供参考。

1 CTC的检测方法

1.1 主要检测方法 CTC是实体肿瘤或转移灶释放入外周循环的肿瘤细胞，具有原发性肿瘤的生物学特性。恶性肿瘤患者的CTC计数通常极低，约109个红细胞或106～107个白细胞中仅能检出1个CTC，而且CTC容易聚集成微栓，这影响了CTC的检测[9]。目前用于检测CTC的方法主要有免疫磁性分离富集和基于形态学的分离富集。其中免疫磁性分离富集的应用最为广泛，包括CellSearch®、NanoVelcro®、CanPatrol®、CTC-Chip、免疫磁性细胞分选仪、iFISH®、AdnaTest®检测系统等。基于免疫反应原理，CTC分选富集方法可分为正性分选及负性分选。其中，正性分选是使用针对肿瘤相关抗原的特异性抗体，对目标CTC进行捕获和富集；而负性分选则是利用白细胞抗原(如CD45)来去除白细胞。目前，美国食品药品监督管理局仅批准了CellSearch®系统用于CTC的临床检测，其可用于乳腺癌、结直肠癌及前列腺癌患者，该技术方法能够在分选富集CTC同时，较好地保存细胞形态结构，且商品化的半自动检测仪可使操作流程明显简化，相应的技术标准也得到了临床的验证[10]。CellSearch®系统的检测原理主要是通过偶联上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、细胞角蛋白(cytokeratin，CK)等肿瘤特异表面标志物来富集CTC。经免疫分选富集后获得的CTC还需进一步鉴定，主要方法是固定CTC后使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚荧光染料标记细胞核，使用CD45、CK8、CK18、CK19、Ckmix等荧光抗体标记CTC细胞，荧光显微镜下的EpCAM+DAPI+CD45-CK+细胞即可定义为CTC[11]。

1.2 新型或改良检测技术 目前针对CTC检测的临床价值研究大多是基于CellSearch®系统进行，而新型CTC检测技术的开发也多使用CellSearch®系统作为对照。有研究者在尝试开发新型CTC分选富集方法以改进CTC的临床检测方法，并取得了一些进展。例如，Pang等[12]开发了一种新型的拉曼散射生物感受器(使磁珠表面的磁性增强)来检测肝细胞癌患者的CTC，这种生物感受器包含2个主要组成部分，即抗脱唾液酸糖蛋白受体抗体-Fe3O4-Ag复合纳米粒子及抗磷脂酰肌醇蛋白多糖3抗体-Au-Ag-5，5-二硫二硝基苯甲酸纳米棒；基于临床标本的验证试验结果显示，当血液样本中的肝细胞癌相关CTC在1～100个/mL的浓度范围内，该系统检测具有较好的线性相关性，具有潜在的临床检测价值。Xue等[13]构建了集成细胞差相富集与免疫荧光原位杂交的iFISH®检测平台，临床验证试验显示，iFISH®对肝细胞癌 CTC的检测率高于CellRearch®，其检出肝细胞癌患者的CTC计数也高于CellSearch®。Liu等[14]开发了一种基于高细胞核质比(high karyoplasmic ratio，HKR)来分选富集CTC的方法，这种方法无须使用肿瘤特异性标志物对肝细胞癌相关CTC进行标记；验证试验结果显示，肝细胞癌患者外周循环中的HKR细胞计数明显高于无肝细胞癌者，且存在微血管侵袭的患者HKR细胞计数更高，此外HKR细胞计数用于诊断肝细胞癌的受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积也高于基于EpCAM+分选富集的CTC计数。上述研究结果为改进应用于肝细胞癌患者的CTC分选富集方法，提供了重要参考。

2 CTC用于肝细胞癌的临床诊断

无创生物学指标在肝细胞癌的早期筛查及诊断中具有重要的临床价值，其中应用最广泛的指标是血清甲胎蛋白，国内外各大指南均推荐对肝细胞癌患者(包含疑似患者)常规检测甲胎蛋白，并在肝细胞癌治疗随访的全过程中将甲胎蛋白作为重点监测指标[15]。然而，外周循环中的甲胎蛋白易受机体其他疾病(如卵巢癌、急慢性肝炎、睾丸癌等)或生理状态(如妊娠、肝病后肝脏细胞再生等)的影响，临床上也存在大量全程无甲胎蛋白升高的肝细胞癌患者，从而降低了甲胎蛋白诊断肝细胞癌的准确度[16-17]。因此，临床上也一直在寻找更为准确的无创生物学指标，以提高对肝细胞癌的诊断效能。CTC作为直接来源于肝细胞癌瘤体的脱落细胞，理论上，只要检测方法足够准确，检测CTC等同于对肿瘤组织进行直接活检，且CTC的检测方法具有无创性和可重复性，是十分有价值的无创生物学标志物。

一项荟萃分析结果显示，CTC计数用于诊断肝细胞癌的总体ROC曲线下面积可达0.93(95%CI：0.90～0.95)，且CTC阳性与无复发生存率及总体生存率存在相关性[18]。这提示CTC计数在肝细胞癌的临床诊断方面具有良好的价值。Court等[19]基于NanoVelcro®CTC检测平台，使用脱唾液酸糖蛋白受体、聚糖蛋白-3及Ep-CAM作为肿瘤特异性表面标志物对富集CTC进行鉴定，结果显示，在97%的肝细胞癌患者中检出了CTC，CTC计数(当最佳截断值为6个/mL时)用于鉴别诊断肝细胞癌患者与健康人的ROC曲线下面积可达0.92，其诊断灵敏度和特异度分别为0.842和0.885；此外，波形蛋白阳性的CTC(EpCAM+细胞的亚组)用于鉴别诊断早期与局部转移患者的ROC曲线下面积可达0.89，诊断灵敏度及特异度分别为0.871及0.900。Chen等[20]使用了Canpatrol® CTC平台对肝细胞癌患者的CTC进行检测，结果显示在95%的患者中检出了CTC，CTC计数与肿瘤巴塞罗那分期、远处转移及血清甲胎蛋白水平具有相关性，CTC计数鉴别诊断肝细胞癌转移与非转移患者的ROC曲线下面积可达0.861(95%CI：0.782～0.940)。此外，该研究结果还显示，在肝细胞癌患者中上皮性、混杂性和间充质性CTC的检出率分别为53%、83%及57%，而手术后复发患者的混杂性和间充质性CTC比例更高，说明混杂性及间质性CTC是更具有侵袭性及远处转移能力的CTC表型。上述研究结果均提示，CTC在肝细胞癌的临床诊断及预后评估具有良好的应用价值，这为针对肝细胞癌的无创诊断提供了重要参考。

3 CTC用于肝细胞癌的临床预后评估

CTC作为从实体肿瘤脱离的细胞，仍具有肿瘤相关的生物学特性，包括增殖、侵袭及转移能力，在外科手术切除或其他方法治疗后，若仍能检测出CTC，则提示患者存在复发的风险或已存在隐匿性的远处转移[21]。因此，CTC计数在评估肝细胞癌预后方面具有重要的参考价值，尤其是对于接受手术或其他辅助治疗的患者，CTC计数可用于评估复发及远处转移风险。

3.1 CTC计数与患者临床预后的关系 肝细胞癌患者的CTC计数与肿瘤分期、门静脉癌栓形成及远处转移等临床预后因素相关。Ogle等[22]使用了CK、EpCAM、甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白多糖3及DNA依赖性蛋白激酶作为特异标志物来检测肝细胞癌患者的血液CTC计数，最终在65.2%的肝细胞癌患者中检出了CTC，而健康对照组均未检出CTC；同时发现肝细胞癌患者的CTC计数与肿瘤大小及门静脉癌栓形成相关，CTC计数>1个/mL的患者中位生存时间仅为7.5个月，明显低于CTC计数<1个/mL患者的34个月，CTC计数是影响患者远期生存的独立危险因素。Ou等[23]的研究结果显示，70.9%的肝细胞癌患者CTC阳性(≥2个/5 mL)，CTC计数及间充质CTC(mesenchymal CTC，MCTC)与高甲胎蛋白水平、多发病灶、高TNM/巴塞罗那分期、存在肿瘤栓子相关；此外，MCTC计数还与肝细胞癌早期复发相关，可用于预测无短期复发生存率。Qi等[24]采用CanPatrol®CTC富集技术检测了肝细胞癌患者的CTC计数，结果显示， 90.18%的患者可检出CTC(包含并无远处转移证据的早期肝细胞癌患者)，术前CTC计数≥16/mL及间充质样CTC比例≥2%与早期复发、肝内多处复发及肺转移相关；此项研究也同时发现，CTC阳性的慢性乙型肝炎病毒感染患者，在随访5个月内出现了早期肝细胞癌。上述研究结果均提示，早期CTC计数用于评估肝细胞癌患者的临床预后具有重要价值。

3.2 CTC计数与手术后患者预后的关系 肝细胞癌患者接受外科手术或其他辅助治疗后，CTC计数也可作为复发、转移及远期生存的参考指标。例如，Yu等[25]的研究结果显示，肝细胞癌患者在手术切除肝细胞癌后，总体CTC计数反而较术前显著升高，手术后CTC升高(≥2个/mL)的患者较低CTC(<2个/mL)患者的无病生存期及总生存期更短。Li等[26]发现，肝脏肿瘤患者(43例肝细胞癌及7例肝转移肿瘤)行射频消融术后3 d的CTC水平明显升高，且CTC计数升高与肝细胞癌早期复发相关。分析上述研究结果的原因，可能是手术(消融)创伤直接导致部分肿瘤细胞从瘤体上脱落而形成了CTC，因此在手术切除肿瘤时应更为小心，避免对瘤体的物理挤压及损伤。而Hao等[27]的研究结果则显示，EpCAM+CTC≥3.5个/mL的肝细胞癌患者手术切除后的复发率更高于<3.5个/mL的患者，前入路肝切除的患者CTC计数较传统入路肝切除患者更低、远期预后更好。这从侧面反映了肝细胞癌患者术后CTC计数升高的原因，即前入路肝细胞癌切除对瘤体的挤压更少，从而避免了CTC形成。Zhou等[28]的研究结果显示，手术前CTC及调节性T细胞计数较高的肝细胞癌患者发生术后复发的风险高于低计数水平患者，且EpCAM+CTC≥2.22/mL是患者术后1年内复发的独立危险因素。还有研究显示，特定亚型的CTC及EpCAM+的循环肿瘤干细胞用于预测手术后肝细胞癌的复发具有较高的临床应用价值[29]。

4 小 结

CTC计数用于肝细胞癌的临床诊断及预后评估具有重要的临床价值。目前在肝细胞癌CTC检测方面存在的问题主要有分选富集方法不够高效，CTC的鉴定特异度有待提高，以及对实验室及设备要求较高等。随着CTC检测技术的不断完善以及临床证据的积累，CTC必将在肝细胞癌的临床诊治中得到更广泛的应用，从而使患者更大获益。