羽毛角蛋白降解的研究进展

◆作者：彭俏丽 张辉华＊

◆单位：佛山科学技术学院生命科学与工程学院

近年来，随着我国规模化养殖模式的推广，畜禽养殖业迎来高速发展，但与此同时也产生了大量的养殖废弃物，其中包含羽毛、毛发、蹄等。羽毛中富含角蛋白，角蛋白是一种硬性蛋白，具有稳定的结构，很难被直接利用。数据显示，按照羽毛质量占活禽总质量的5%～7%进行计算，我国每年产生的羽和毛等角蛋白高达数百万吨。大量的羽毛的堆积不仅会造成严重的环境污染，还浪费大量的蛋白质资源。因此，在生态环境要求以及我国蛋白质资源短缺的情形下，对羽毛角蛋白的开发利用具有十分重要的意义。

1 羽毛角蛋白结构和性质

角蛋白分为硬角蛋白和软角蛋白。在两种不同类型的角蛋白结构中，硫的含量不同，使角蛋白具有更软或更硬的结构，并在更大程度上影响角蛋白材料的降解。在动物的毛发、羽毛、鳞片、蹄、鼻、角、爪等结构中普遍存在一种具有很强抗性的硬角蛋白（Dudyński 等,2012），含硫量约占干重的5%；而人表皮中的软角蛋白含硫量约占干重的1%（Fellahi 等,2016）。

角蛋白一级结构由19 种α- 氨基酸组成，其中氨基酸的组成及其分子结构决定了角蛋白具有不易降解的特性（Brandelli 等,2010）。不同来源的角蛋白，其组成氨基酸的种类和含量也会有所不同。角蛋白二级结构由α- 螺旋或β- 折叠组成。根据二级结构的差异，可将角蛋白分为α- 角蛋白和β-角蛋白。其中，α- 角蛋白的伸缩性能较好，人和动物毛发中的角蛋白多属于此类；β- 角蛋白的抗张性能较好，主要存在于动物的蹄、 角及鸟类羽毛中（Sivakumar 等,2015）。

角蛋白内部由于存在分子间的疏水力、氢键、盐键，以及不同肽链间由胱氨酸残基所产生的二硫键相互高度交联形成的三维稳定结构，使得角蛋白不溶于水且一般情况下难以被水解。其中，分子间的二硫键需要强烈的还原反应才能使其断裂，而肽键需要在高特异性角蛋白酶的作用下才能被水解（Marshall 等,1991）。

2 羽毛角蛋白降解的方法

羽毛中角蛋白含量高达90%，但因其结构稳定不易被降解，造成角蛋白资源极大的浪费（尹红梅等,2020）。如何有效地降解并利用角蛋白资源就显得尤为重要。目前，国内外常用的角蛋白的降解方法主要是物理（高温高压、膨化）降解法、化学（强酸强碱、氧化还原、电化学还原）降解法和生物（酶解）降解法。

2.1 物理降解法

在高温高压的条件下，角蛋白中的二硫键、氢键等结构断裂，稳定的空间结构被破坏，变成可溶性蛋白的方法，称为物理降解法。包括高温高压水解法和膨化法。

2.1.1 高温高压水解法

高温高压水解法是我国生产羽毛角蛋白饲料的常用方式。利用高温（100～200℃）和高压（0.294M～0.98 MPa）将羽毛角蛋白转变成易消化的可溶性多肽混合物，真空干燥后形成羽毛粉（Yin 等,2007）。处理温度、时间和压力是影响羽毛粉质量的关键因素。但该法所应用的设备多且降解工艺较为落后，参数难以控制，产品质量得不到保障。另外，持续的高温高压易使得角蛋白严重变性，甚至会造成部分氨基酸的损失。同时，生产过程中产生的“三废”问题易对环境造成污染。

2.1.2 膨化法

膨化法与高温高压水解法不同。膨化法在高温（230 ℃）高压（1.0M～1.5MPa）高剪切力的基础上，进行快速（2.5 min）减压膨化，破坏角蛋白的空间结构，形成的肽链易于被动物消化吸收（王晶，2007）。该工艺较水解法简单，设备少、成本低、污染少。但由于膨化过程使得二硫键断裂造成半胱氨酸的利用率降低。因此在实际应用过程中，常与酶处理法联合应用，以达到提高角蛋白利用率的目的。

2.2 化学降解法

利用酸或碱或氧化还原等方法，破坏二硫键，使不溶性角蛋白成为可溶性蛋白质的方法称之为化学降解法（Coward-Kelly 等,2006）。包括酸碱水解法、氧化还原降解法和电化学还原法。

2.2.1 酸碱水解法

利用强酸或强碱处理角蛋白，破坏其稳定的空间结构，从而获得可溶性的角蛋白。该种方法要求适宜的酸碱浓度、反应温度和反应时间，其中反应时间对产品分子量的大小和产率具有重要影响（贾如琰等，2008）。但是酸碱水解法对氨基酸的破坏较为严重，同时产生过多的盐分，不利于动物的生长。另外，在生产过程中容易腐蚀金属，对水体和土壤的污染较为严重。

2.2.2 氧化还原降解法

利用氧化剂将角蛋白中的二硫键氧化成磺酸基，使不溶性的角蛋白水解成可溶性的蛋白质的方法称之为氧化法。氧化过程中肽链易断裂，因此氧化法不易获得高分子量产品。氧化剂一般为过氧化物，如过氧化氢、过甲酸、过乙酸等。

利用还原剂将角蛋白中的二硫键还原成巯基，使不溶性的角蛋白水解成可溶性的蛋白质的方法称之为还原法。与氧化法不同，还原法在还原过程中对肽链的影响较小，所获得的产品不仅分子量大，而且产率较高，是当前最常用的化学方法。还原剂一般为巯基化合物，如巯基乙酸、巯基乙酸钠等。但巯基的性质较为活泼，要获得稳定的角蛋白产品，还需添加保护剂避免巯基被氧化。常用的保护剂为鼠李糖脂或表面活性剂等，其中表面活性剂可提高角蛋白的可溶性，提高动物的消化率（Ozdemir 等，2006）。

2.2.3 电化学还原法

利用电解液，使角蛋白发生氧化还原反应的方法称为电化学还原法。电解槽接通电源后，角蛋白发生还原反应，使得二硫键断裂形成巯基，巯基与电解液中的其他离子进行结合以避免再次氧化（贾如琰等，2008）。通过反复的渗透、透析之后获得可溶的角蛋白。但该法过程较为复杂，且产物不纯。

2.3 离子液体降解法

离子液体是指全部由离子组成的液体，它具有不燃、无味、可循环利用、蒸汽压低、不挥发等特点（Idris 等，2013）。在不同阴阳离子结构的离子液体中，微波加热条件下，大分子之间的极性变强，分子之间化学键的剧烈震动使得角蛋白中的二硫键和氢键发生断裂而溶解，这种方法称为离子液体降解法。值得注意的是，角蛋白溶解效率较高，且并未发生任何的化学反应。因此，离子液体降解法具有较好的发展前景。

2.4 生物降解法

利用微生物或者角蛋白酶对角蛋白进行处理，使其空间结构遭到破坏，从而增加角蛋白溶解性的方法称之为生物降解法，又称酶解法。角蛋白酶是一类能降解角蛋白的酶，具有专一性。目前发现产角蛋白酶的微生物主要有真菌、细菌和放线菌。

2.4.1 产酶菌的种类

2.4.1.1 真菌

早期记录的产角蛋白酶的真菌是1899 年Ward 发现的马爪甲团囊菌（Onygena equina），同时这也是人类最早发现的能够对角蛋白进行降解的微生物（Agrawal 等,1980）。之后人们逐渐从禽类羽毛、土壤或污泥中分离出来多种可降解角蛋白的真菌，如小孢子菌（Microsporum）、发癣菌（Trichophyton）、须毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）、白色念珠菌（Canida albicans）、许兰毛癣菌（Trichophyton schoenleinii）、Soprophytes、Dermatophyte 和Scopulariopsis brevicaulis 等，但由于绝大部分属于致病性的皮肤真菌，用处不大。也有不少其他真菌，如黄曲霉，但由于黄曲霉产生毒素，从而抑制了其在降解角蛋白方面的应用。与黄曲霉不同，微孢长囊头孢霉菌不仅不产生毒素，还能很好地降解人体角质层（Gradisar等,2000）。 另外，Trichoderma，Alternaria，Curvularia，Penicilium等也有较好的降解效果。

2.4.1.2 细菌

早期记录的可产角蛋白酶细菌是1990 年Williams 等人发现的地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis PDW-1（Williams等，1990）。目前发现的可产角蛋白酶的细菌多为芽孢杆菌，其中又属地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌最多。除上述的地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis PDW-1外，还有如枯草芽孢杆菌BS8（何周凤等，2015）、枯草芽孢杆菌KD-N2（ZHENG 等，2008）等。细菌菌属也逐渐引起了人们的注意，如芽孢八叠球菌GIMN1.015（顾振红等，2013）、藤黄微球菌B1pz（Wojciech 等，2015）、金 黄色节杆菌N01（周童娜等，2015）等。另外，部分嗜热耐碱的细菌在工业生产中具有极大优势，展现出良好的发展势头，如Fervidobacterium （Nam 等，2002），Nesternkonia （Gessesse 等 ，2003），Thermoanaerobacter（Kublanov 等，2009）等。

2.4.1.3 放线菌

早期记录的可产角蛋白酶放线菌是1958 年Nickerson 等人发现的弗氏链霉菌（Nickerson 等，1959）。放线菌一般具有较强的降解角蛋白的能力，且大多属于链霉菌属。如链霉菌菌株16（Xie 等,2010）、链霉菌Streptomycesgulbargensis（Koutchma 等，2009）、嗜热的禾生链霉菌Thermotolerant Streptomyces graminofacients（Szabó 等，2000）等。

2.4.2 酶解机理

普遍认为，微生物降解角蛋白的过程主要分为三个步骤：变性作用、水解作用和转氨基作用。

（1）变性作用

角蛋白变性是角蛋白降解的第一步，而二硫键的断裂是角蛋白变性的关键。关于二硫键的断裂有多种说法：通过胱氨酸的直接还原而变性（Kunert 等，1989）；利用还原剂如巯基乙酸盐、二硫苏糖醇等使二硫键打开；角蛋白酶本身含有二硫键还原酶，它首先作用于角蛋白二硫键，使角蛋白变性（涂国全等,1998）。但值得注意的是，有研究表明在角蛋白降解时并未检测出巯基的存在（Sherine 等，1997）。另外，角蛋白酶是否含有二硫键还原酶或含有的二硫键还原酶是否具有活性，目前还未能证明。

（2）水解作用

蛋白质变性后丧失其稳定结构，在角蛋白酶等的作用下，逐渐被水解为寡肽、多肽和游离氨基酸（涂国全等，1998）。

（3）转氨基作用

研究表明，角蛋白被水解为肽类和游离氨基酸之后，通过转氨基作用将角蛋白中的氮转化成氨气，这种转氨基作用在微生物降解过程中，常被称为氮源的削减现象（Kunert 等，1989）。

2.4.3 酶解的影响因素

微生物降解角蛋白过程受到诸多因素的影响。不同温度和pH 对不同的角蛋白酶活性均有所差异，进而影响酶解的效率。另外，蛋白质的变性对酶解具有关键作用，同时，微生物降解角蛋白过程中的氮源削减现象不容忽视。因此，酶解的影响因素主要有温度、pH、还原剂、金属离子和碳源氮源等。

大多数角蛋白酶的最适温度介于30～70℃。由于角蛋白酶的自解，部分角蛋白酶活性会随着反应温度的升高或降低而有所改变，如：Streptomyces gulbargensis DAS 131 角蛋白酶（Koutchma 等，2009）；部分角蛋白则适宜更低或更高的温度而不影响其稳定性，如：寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）D1 最适温度为20℃、Fervidobacterium islandicum AW-1 最适温度为100℃（Lee 等，2015）。另外，弧菌科的最适生长温度（30℃）与其所生产角蛋白酶的最适温度（55℃）并不一致。大多数角蛋白酶的最适pH 介于7.0～10.0。如短小芽孢杆菌所产生的角蛋白酶最适pH 为9.0。部分人体腐生真菌所产角蛋白酶适宜较低的pH，如Trichophyton schoenleinii所产生的角蛋白酶最适pH 为5.5（Qin 等,1992）。实验表明，只有角蛋白变性之后，角蛋白酶才能发挥作用。还原剂如巯基乙醇等可将角蛋白质中的二硫键断裂，使角蛋白高级结构解体，为角蛋白酶发挥水解功能提供条件，提高水解效率。但应考虑还原剂是否会作用于角蛋白酶中的二硫键，避免产生负效应。另外，不同的金属离子对角蛋白的降解影响具有差异性。低浓度的Ca2+、Mg2+等二价金属离子有利于促进角蛋白酶的活性，但Hg2+、Pb2+等则抑制其活性。碳源或氮源的添加也会导致角蛋白降解效率降低。

3 羽毛角蛋白的应用

3.1 动物饲料

蛋白质是动物生长发育必需的三大营养物质之一，常见的蛋白质饲料有鱼粉、大豆以及豆粕等。而中国蛋白质饲料较为缺乏，蛋白质资源短缺是制约中国养猪行业的一大重要因素。数据显示，2020 年1-3 月中国大豆进口量达到1779 万吨，相比上年同期增长了104 万吨，累计增长6.2%，交易金额达7187.3 百万美元。角蛋白是一种优质的天然蛋白，而羽毛中含有90%左右的角蛋白，同时包含大量半胱氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺等氨基酸、常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子，其中胱氨酸是天然蛋白饲料中含量最高的（Saravanan 等 ,2012; Tseng,2011）。研究发现，生物技术提取的羽毛角蛋白的体外消化率可达98.5%，与大豆蛋白仅差1.0%（Grazziotin 等,2006）。我国每年的废弃羽毛多达数百万吨，利用角蛋白酶水解角蛋白制成动物饲料，不仅高效，而且能耗较少，更经济环保。

3.2 医药

羽毛角蛋白具有较好的生物相容性、细胞亲和性和生物可降解性，在生物医药方面具有较多的应用。比如将羽毛角蛋白降解为可溶性蛋白质后，与其他高分子材料形成高分子聚合物，应用于医药制品、人工支架等；制备生物凝胶用于神经缺损修复；制备角蛋白膜作为药物载体等。另外，还可利用角蛋白获取复合氨基酸溶液，替代部分人血浆，用于肝病的治疗等。

3.3 肥料

氮、磷、钾统称为“肥料三要素”，其中氮肥被称为植物的基本元素，可提高作物产量、改善农产品质量。有机农业生产中最常用的是粪肥，而我国羽毛废弃物量多易得，经加工后羽毛粉含氮量为5%，可替代较昂贵的粪肥。利用角蛋白可获取氨基酸螯合剂，提高农作物对微量元素的利用率（许立和,2002）。另外，有研究表明，酶解后的羽毛具有良好的肥力效果，可用于生产液体氨基酸复合肥（Suh 等,2005），有利于提高作物产量，降低成本。

4 结语

我国每年有大量的废弃羽毛，羽毛中含有约90%的角蛋白。羽毛角蛋白是一种优质的天然蛋白质资源，但由于二硫键、氢键等的作用使得角蛋白结构稳定而难以降解，往往造成资源浪费，环境污染。目前常用物理和化学降解法，降解的效率较为低下，工艺复杂，能量损耗大，且污染环境。而生物降解法能有效地改善上述问题，更为高效环保。另外，生物降解角蛋白在动物饲料、医药和肥料等方面具有极大的应用价值，一定程度上可以解决我国蛋白饲料资源短缺的问题，促进医疗和农业的发展。