促进肌腱-骨界面愈合技术研究进展

韩泽宇 郝跃峰 钱胤华 周静 邵志强

肌腱-骨界面是软组织向骨转化的特殊移行区域，由肌腱、未钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨组成[1]。治疗肌腱或韧带损伤的主要手术方式是将其缝合至骨面或骨髓道，修复后肌腱-骨界面复合结构能否恢复正常将影响其关节运动学和动力学的恢复。而肌腱、韧带损伤修复术后，患者常出现瘢痕愈合[2]，导致治疗效果欠佳[3-4]。目前，越来越多的研究致力于促进肌腱-骨界面修复和再生的探索，以求恢复正常的肌腱-骨界面复合结构。促进肌腱-骨界面愈合的技术较多，主要涉及生长因子和富血小板血浆(PRP)的应用，以及细胞学及材料学等方面，本文对这些技术的研究进展作一综述。

1 生长因子

应用于促肌腱-骨界面愈合的生长因子主要有转化生长因子(TGF)-β、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等[5-6]。

TGF-β具有抑制和刺激细胞增殖的双向调节作用，其有3种亚型[7]。Wang等[8]采用自体移植兔前交叉韧带重建模型进行实验研究，结果显示TGF-β可促进肌腱-骨愈合。Kim等[9]的研究发现，抑制TGF-β不利于肌腱-骨界面的愈合，表现为机械性能下降。其中，抑制TGF-β1可导致瘢痕组织形成，抑制TGF-β3则使愈合过程无明显改善。虽然通过控制TGF-β亚型可促进肌腱-骨界面的再生愈合，但尚未达到恢复正常复合结构的程度。

BMP是TGF-β超家族信号转导蛋白的一员，其通过结合到间充质细胞的TGF跨膜细胞表面受体来激活BMP信号级联效应，促进细胞分化和组织形成[10]。Lee等[11]研究发现，将胶原凝胶负载重组人BMP-2注射到肌腱-骨交界处，可促进新骨形成，并提高其生物力学强度，从而促进肌腱-骨界面的愈合。Schwarting等[12]在体外动物模型实验中进一步探索BMP-2在肌腱-骨界面整合中的生物学作用。他们发现，应用BMP-2可触发成骨细胞、成纤维细胞和界面区转分化过程的启动，上调界面区细胞外基质的形成和BMP受体表达，下调BMP-2拮抗剂Noggin的表达，进而促进肌腱-骨界面的愈合。然而，应用BMP-2的有效性和安全性还需进一步研究。

VEGF是一种内皮细胞有丝分裂原，其可促进血管生成，增加毛细血管通透性，并有助于术后早期肌腱和骨之间的纤维整合[13-14]。Setiawati等[14]采用兔半腱肌肌腱重建前交叉韧带，然后在骨隧道内注射VEGF，并以纤维蛋白胶封盖隧道。术后6周发现，骨隧道内Ⅲ型胶原纤维密度增高，相应的肌腱-骨界面和隧道直径逐渐减小，生物力学分析显示肌腱移植隧道的极限抗拉强度增大。他们认为，VEGF可促进肌腱-骨界面的愈合。

FGF家族可调节机体的发育过程、组织内稳态和代谢活动，其具有促有丝分裂和细胞保护功能，并有血管生成潜力[15]。Lu等[16]研究发现，酸性FGF对包括成骨细胞和软骨细胞在内的中胚层来源细胞具有明显的促有丝分裂作用，并可刺激新生毛细血管形成，从而对肌腱-骨界面的修复起到积极作用。Yonemitsu等[17]对慢性肩袖撕裂大鼠模型进行研究，发现碱性FGF通过刺激修复中的张力愈合反应来提高肌腱-骨界面的生物力学强度。

研究已证实，G-CSF在适当环境中可促进血管生成，进而促进组织修复[18]。Ross等[6]采用大鼠冈上肌肌腱离断修复模型进行研究，结果显示，注射G-CSF后冈上肌肌腱与肱骨头之间细胞募集明显增加，不过肌腱修复后的力学性能恢复仍较慢。

2 细胞学技术

近年来，细胞学技术促进肌腱-骨界面愈合的研究受到广泛关注。在这些研究中细胞学技术常与其他技术联用，采用的细胞包括干细胞和非干细胞，主要有间充质干细胞和来源于前交叉韧带的血管CD34+干细胞，同种异体真皮成纤维细胞和人肩峰下囊细胞。

2.1 间充质干细胞

间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞(BMSC)、脂肪源性间充质干细胞(ADSC)、肌腱间充质干细胞、人脐血间充质干细胞。研究表明，间充质干细胞通过分泌大量生长因子、细胞因子和囊泡对肌腱-骨界面的愈合起积极作用[19]。

研究表明，BMSC在软组织修复动物模型中具有抗炎，促肌腱和韧带修复的作用[20]。Lu等[21]的研究认为，取自新鲜自体骨髓的BMSC和同种异体BMSC均有促肌腱-骨界面愈合的作用。目前，BMSC多来源于骨髓抽吸物，但存在有效浓度较低，数量和分化能力随年龄下降等不足，限制了其应用。

人脂肪组织含量丰富，易获取，且数量恒定，因而ADSC的获取较容易。ADSC通过旁分泌作用和促分化作用对肌腱-骨界面愈合产生积极影响。然而，对于ADSC治疗肩袖撕裂的疗效仍存在争议。Kim等[22]的研究显示，关节镜修复术后注射负载ADSC的纤维蛋白胶可降低肩袖再撕裂率，但在远期疗效研究中并未显示优势。Lipner等[23]研究发现，对已修复的肌腱-骨界面进行额外的ADSC植入，在生物力学、骨形态或组织学结果上并无有利影响。综上所述，ADSC对肌腱-骨界面愈合的作用仍需进一步研究。

研究表明，将肌腱间充质干细胞用于肌腱-骨愈合治疗中，肌腱-骨整合更好，关节内移植物完整性较高，细胞密度和血管密度较低，细胞排列较好，胶原双折射性较高，极限载荷更高，其具有明显促进前交叉韧带损伤早期愈合的作用[24]。

干细胞促进肌腱移植物骨整合的研究多采用自体间充质干细胞，多数研究疗效明显。然而应用自体间充质干细胞存在一些不足，如骨髓抽吸为高度侵入性操作，需进行细胞提取和再提取细胞应用的二次手术操作。

人脐带血来源的间充质干细胞(hUCB-MSC)具有免疫原性低，再生能力强，非侵入性收集等优点。Jang等[25]采用hUCB-MSC处理骨隧道，术后肌腱-骨界面处可见具有成熟软骨细胞的高级纤维软骨愈合，骨隧道明显变小。

2.2 非间充质干细胞

研究发现，损伤的前交叉韧带残留细胞中存在CD34+干细胞，随时间推移，这些细胞可从造血细胞表型转变为间充质干细胞表型[26-27]。Inokuchi等[27]的研究证实，CD34+干细胞具有成骨和成血管特性，与前交叉韧带损伤的老年患者相比，自年轻患者中提取的CD34+干细胞对于前交叉韧带重建后的肌腱-骨界面愈合更有帮助。但是，目前该方面研究较少，对其促进肌腱-骨界面再生或愈合方面的作用还需开展更多研究。

2.3 非干细胞疗法

同种异体真皮成纤维细胞因与肌腱细胞都来自中胚层，具有相似形态，并产生相同的细胞外基质成分[28]，且容易获取，研究者们开始将其作为新的替代方案。Kwon等[29]的研究表明，在肌腱-骨界面处注射含纤维蛋白的同种异体真皮成纤维细胞，其负载极限值较高，组织学检查显示胶原纤维连续性更高。

有学者提出，肩峰下囊在肩袖撕裂时的伸展是一种修复反应，而不是退行性改变，这可能表明肩峰下囊组织在肩袖关节疾病中具有生物学活性。有研究表明，来自人肩峰下囊细胞的体外特性显示，其表面抗原表达与BMSC相似，具有类似间充质干细胞的所有特征，包括具有增殖和软骨分化、成骨分化、成脂分化的潜力[30]。Morikawa等[31]为寻求可最大限度获取肩峰下囊源性有核细胞的非酶解方法采取以下4种不同方法处理肩峰下囊样本：剪刀机械消化法、胶原酶消化法、组织匀浆机机械消化法、最少操作全组织消化法。研究发现，使用机械法分离肩峰下囊源性细胞可获得与胶原酶法相似的有核细胞数量。他们建议，在肩袖修复后可将肩峰下囊放入修复部位，并置于顶部。

3 生物材料学技术

生物材料促进肌腱-骨愈合的关键在于可加强细胞与材料之间的相互作用，表现为促进细胞黏附、基质生成、细胞增殖分化。目前，应用于肌腱-骨界面的生物材料主要有天然聚合物[32-33]、合成聚合物[34]、脱细胞支架[35]。依据生产工艺不同，材料的表现形式有薄膜、水凝胶、海绵或泡沫多孔支架、网状物、微米或纳米纤维[36]。

3.1 天然聚合物

天然聚合物具有高生物相容性、高生物活性、高生物降解性等优点。Cai等[32]分别采用随机支架和双层随机排列丝素蛋白纳米支架来促进跟腱损伤的愈合。他们发现，采用不同支架组的骨隧道面积均明显减小，移植骨界面BMP-2和骨桥蛋白表达水平均升高。与随机支架组相比，双层随机排列丝素蛋白纳米支架组的肌腱-骨界面异色质面积明显增加，界面宽度明显减小，胶原成熟程度和组织化程度明显提高，Ⅰ型胶原表达水平明显增高，在极限负荷和刚韧度方面表现更好。Qian等[33]研究发现，与排列支架相比，随机支架或随机胶原支架结合针织丝素蛋白在细胞黏附和成骨诱导方面具有更好效果，提示将其用于肌腱-骨界面愈合的效果更好。但天然聚合物也存在不足，如丝素蛋白需要预先处理以避免发生免疫排斥反应[37]，胶原的拉伸强度和弹性应变均较低[38]。

3.2 合成聚合物

合成聚合物可补充天然聚合物材料的不足，具有高弹性和高孔隙率，可依据需要调整成品的形状和大小，可对材料进行功能优化等优点。Guo等[34]采用电子束蒸发技术在聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜表面涂覆一种新型生物活性磷酸钙硅酸盐陶瓷，制备化学成分类似于肌腱-骨界面的可裁剪复合膜，他们发现改变性能后的样品更利于细胞附着和增殖，且显示出更好的成骨活性。

3.3 脱细胞支架

脱细胞支架兼具免疫原性低，生物降解性和生物相容性高，机械性能与天然组织相似，含有丰富的内源性整合素结合位点等优势。Chen等[35]将天然纤维软骨组织切片制成书本状，以提高细胞载量和浸润能力，并对其进行脱细胞处理。进一步的体外研究表明，这种支架无细胞毒性，且免疫原性低，允许ADSC附着和增殖，具有良好的软骨诱导活性，并能刺激胶原或糖胺聚糖分泌。同时体内研究显示，单独使用这种支架可诱导内源性细胞再生纤维软骨，表现为纤维软骨在细胞外基质沉积和良好的界面整合。

4 PRP技术

PRP是一种血小板含量较高的自体血浆制剂，一旦被激活，就会成为含有丰富生长因子的凝胶状支架，它们因子包括血小板衍生生长因子、TGF-β、VEGF、胰岛素样生长因子，它们均参与肌腱-骨界面的愈合中[39]。大量研究显示，PRP与生物材料联合应用具有良好效果。Zhou等[40]将PRP与化合物Kartogenin结合，通过在大鼠肌腱-骨隧道注射不同物质进行实验研究。他们从研究结果推测，PRP促进肌腱-骨隧道界面整合可能因其能促进细胞增殖，而单独应用PRP并不能促进纤维软骨区形成。据此他们提出，为了提高PRP在肌腱-骨界面愈合临床治疗中的疗效，PRP应与“生物化合物”联合使用。Zheng等[39]将PRP与中药淫羊藿结合，并将其植入兔髌骨横行截骨断端之间，结果显示，髌骨-髌腱界面出现新生骨扩大和重塑，胶原纤维结构良好，再生纤维软骨中的蛋白多糖生成旺盛。

5 结语

技术的不断改进和材料的革新给临床治疗肌腱损伤带来新启示，虽然很多研究结果显示这些新技术对肌腱-骨界面愈合有积极作用，但是与恢复正常的肌腱-骨界面复合组织结构的目标仍相距甚远，大部分研究处于动物实验阶段，尚未转化成临床应用，未来还需开展更多相关研究。