诱导胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的培养方法

张 格，朱 涵, 张婧雯，徐雨迪，段铭煊, 张 戈

0引言

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)位于视网膜光感受器和脉络膜毛细血管网络之间,功能多样，在促进视网膜及其光感受器的功能中起着多种作用[1],成熟RPE细胞不具再生能力，RPE细胞的坏死、凋亡等功能异常是引起视网膜变性疾病的主要原因。视网膜变性类疾病主要包括年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)、视网膜劈裂症、视网膜脱落、黄斑水肿、视网膜黄斑衰退症、遗传性黄斑营养不良等，临床上前两者较普遍[2]。ARMD是老年人致盲最主要的原因，此病的发病率日益增多，60岁以上人群发病率达1/10，成为眼科防盲研究的重点课题。RP是一组以进行性光感细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性疾病，是遗传性视觉损害和失明的最常见原因。目前这类疾病在临床上以支持疗法为主,仍无有效延缓或逆转病程的方法。胚胎干细胞(ESCs)是从胎儿组织中的原始生殖细胞或哺乳动物囊胚内层细胞群或经体外分离，抑制分化培养得到的能无限增生、自我更新及具备多向分化潜能的细胞。应用具有无限种子细胞资源的ESCs诱导分化出的RPE细胞，进行体内细胞移植治疗，可补充损伤的视网膜色素上皮细胞，恢复视网膜功能，有望为临床治疗视网膜变性疾病带来希望。目前对于ESCs治疗视网膜变性疾病的研究较多，培养分化方法不断创新，本文旨在收集ESCs诱导分化RPE的培养方法，归纳总结从不同角度作出综述。胚眼发育时,细胞具高度可塑性，易被周围因素影响，在各种信号分子的诱导下,激活细胞内信号通路,使视泡背侧前体细胞朝着RPE细胞定向分化[3]，干细胞向体细胞的诱导分化需精准时空调节，RPE的形成与诱导中重要信号通路的正确表达密切相关[4]。

1细胞因子诱导法

将可影响干细胞分化为RPE细胞的细胞因子(小分子化合物)加至培养基，在ESCs不同分化阶段选择性激活或抑制特异性通路[5]，显著缩短分化时间，提高分化效率，由于无生物源性可避免种间污染和免疫排斥反应[6]。

1.1肝细胞生长因子含肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的人间充质干细胞的条件培养基在体外促进RPE细胞分化与RPE细胞作为细胞片层的增殖，显著诱导干细胞向视神经细胞分化。分化细胞显著表达RPE标志物RAX、PAX6、LHX2和SIX3[7]。HGF具有一定诱导作用，但不能使干细胞彻底分化至RPE，HGF对于干细胞早期向视神经细胞或RPE分化起到导向。HGF在体内是hESCs-RPE细胞正常发育的必要因素，HGF在体外对hESCs-RPE细胞的增殖起促进作用，对于分化的促进没有增殖作用明显。

1.2激活素A激活素A(Activin A)作为信号分子,系生长因子(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员。在分化的1～7d加入Activin A,可显著提高hESCs分化为RPE的效率，较自发分化所产生的色素集落的数目更多且集落更大[8]，在第50d，黑色素灶比率可高达50.7%。流式分析表明得到的RPE能高表达RPE标记物MITF和RPE65。荧光免疫染色检测RPE能表达早期发育的OTX2蛋白以及特有BETS1蛋白[9]。采用PCR检测RPE标记基因,与成熟RPE表达水平相似[10]，Activin A影响RPE的自分泌和旁分泌过程,控制胚眼发育过程中细胞增殖与分化[11]。Activin A还能增强另一种细胞因子烟酰胺(nicotinamide,NIC)诱导分化RPE的作用[12]。除此之外，又可通过特定的信号通路调节RPE迁移[13]。

1.3姜黄素诱导第14d加入姜黄素处理24h，促进细胞增殖并使RPE细胞中的活性氧减少[14]，诱导第3wk便出现肉眼可见的黑色素细胞，第5wk可见大量团块色素细胞。姜黄素法的细胞色素化的时间、色素化细胞的比例和成熟RPE细胞标志物ZO-1、MITF、Pax 6的表达明显优于空白对照组[15]。机制在于姜黄素刺激Wnt/β-catenin信号通路，使Wnt通路下游靶因子、受体和配体表达明显升高。

1.4丝蛋白丝胶丝蛋白丝胶通过刺激NF-κB信号通路上调RPE相关转录产物促进黑色素生成，可替代血清，显著降低感染的风险。用含1%丝蛋白丝胶的DMEM培养基分化12d后即可产生色素，细胞密度与存活率更高，细胞死亡率更小，全流程中均可观察到Ⅰ期～Ⅳ期的黑色素体。经检验RPE相关转录产物(RPE65和CRALBP)及相关蛋白(RPE65和黑色素)水平升高[16]。

2二维和三维诱导分化法

ESCs培养基除去碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，并去除小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，ESCs可自发向RPE细胞分化，包括二维诱导和三维诱导，其中二维诱导包括连续贴壁培养和形成拟胚体继续贴壁培养[17]。

2.1二维分化法

2.1.1连续贴壁培养连续贴壁培养使hESCs在去bFGF培养基自发分化形成RPE细胞，人工分离色素继续贴壁培养，细胞逐渐融合扩大成肉眼可见色素灶，从去除bFGF算起到色素灶可见需1～8wk[17]。纯化hESCs-RPE细胞有两种方法：机械切割法和酶消化分离法，前者是当色素灶扩大至直径1mm时，用25G眼科手术刀切割色素，消化分离，接种于培养皿中继续培养；后者通过两步连续的胰酶消化以分离纯化RPE细胞，将第二次消化的RPE细胞接种于培养皿中继续培养[18-20]。

2.1.2形成拟胚体将hESCs在悬浮培养基中培养成拟胚体在无饲养层基质包被的去bFGF的培养基连续贴壁培养，直至形成色素灶[21-27]。当扩大到能手动分离色素灶时再于培养皿中培养。悬浮培养需1～3wk，开始培养到色素灶肉眼可见需4～8wk[28-32]。

2.2三维分化法hESCs在无血清或生长因子降低的培养基中悬浮培养，或在无血清培养体系中快速聚集成拟胚体，hESCs可以自发形成连续的神经上皮空泡，继而形成含色素的RPE细胞层[33-34]。三维法除可有效诱导hESCs分化为视网膜前体细胞和似胚胎视杯的杯状构造物外，所产生的视杯具有正常的RPE结构。第20d出现色素灶，待其进一步扩大至能人工分离，用上述纯化法将色素灶挑出，连续贴壁培养。在分化中可观察到连续的神经上皮样结构、视杯等。

2.3二维诱导法与三维诱导法比较二维的诱导方法不能模拟体内胚胎发育过程，但三维诱导经历视杯结构，更接近原代分离的RPE细胞。二维和三维培养的RPE样细胞均可检出BEST1+、CRALBP+、RPE65+、PDEF+等RPE标志物[33-34]，当细胞不断分化，上述物质表达上调，但三维培养的细胞表达均低于同时期二维培养的表达水平，并且差距逐渐缩小，说明三维诱导的细胞比二维诱导细胞更幼稚[35]。三维诱导的RPE与二维相比，色素灶出现晚，色素更少和但寿命更长。

3共培养法

3.1细胞共培养技术此技术是在同一种环境下，共同培养2种或2种以上的细胞，因可更好地模拟体内环境，被广泛应用。诱导过程中，若将ESCs与原代成体视网膜细胞或胚眙期未成熟的视网膜前体细胞共培养，则会增加分化效率。

3.2细胞外基质与邻近细胞影响分化将hESCs于小鼠PA6基质细胞上培养2wk可获得神经前体细胞[36]，再接种到人布鲁赫膜或基质胶上进行RPE诱导分化。接种前，hESCs表达高干细胞标志物OCT3/4、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81；在PA6细胞上培养后，形成色素灶并表达β-微管蛋白Ⅲ神经前体标志物；接种在基质胶上的神经前体细胞，21d时高表达RPE标记物ZO-1；接种在布鲁赫膜上的神经前体细胞15d出现色素细胞，高表达RPE标记蛋白。综上，邻近细胞或细胞外基质能够沿光感受器或RPE前体细胞系诱导hESCs，使分化后的前体细胞群体富集。

3.3人视网膜微血管内皮细胞影响分化将hESCs-RPE细胞与人血管内皮细胞共培养6wk。结果表明，RPE特异标记物ZO-1在单独培养和共培养中的表达无统计学差异；共培养对RPE细胞的形态和色素沉着未产生显著影响，然而诱导分化得到的RPE细胞在屏障特性以及刷状缘方面的差异具有细胞系特异性[37]。

3.4单核细胞以及血清影响分化将RPE细胞与不同浓度血清及不同数量单核细胞共培养[38-40]。结果表明单核细胞和血清均对RPE细胞的生长分化有明显促进作用，二者具有协同作用。

若共培养的对象不同，诱导分化的结果不同。但均能获得相应的RPE细胞。共培养模拟体内视网膜细胞生长环境，在外部环境中建立适合细胞定向分化的条件而影响ESCs分化，但分化效率较低，约为传统培养的30%。

4生物支架包埋法

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在体外对视网膜发育十分重要，RPE外环境改变如ECM的变化将对细胞发育产生影响。然而生物支架则模拟天然ECM，包裹并支撑活细胞，具备可加工性、坚固性、相容性、可降解性等优点，使得RPE细胞在植入时较少诱导免疫反应。所以运用合适生物材料及细胞载体支架，模拟RPE细胞在体内发育环境，形成基于视网膜组织工程的治疗方案具有良好前景。

4.1海藻酸盐水凝胶包埋法运用不同的水凝胶(0.5%海藻酸钠、1%海藻酸钠、明胶水凝胶)包埋hESCs制备拟胚体。证明0.5%和1%海藻酸钠均能促进hESCs向RPE分化，与对照组相比，含RPE和视囊泡的拟胚体总数显著增加。但明胶水凝胶组的拟胚体总数改变不明显。所以诱导能力方面，海藻酸钠优于明胶水凝胶[41]。姜黄素/海藻酸钠凝胶共同包埋与纯水凝胶相比，生物相容性好，细胞生长能力增强，ECM形成率高，视网膜功能基因上调，细胞增殖率比纯海藻酸钠水凝胶法提高28%[42]。综上，提高效率首选姜黄素/海藻酸钠凝胶共同包埋法。

4.2纤维蛋白凝胶包埋法纤维蛋白水凝胶作为RPE移植的支撑材料，使RPE保持活性，生成具有特征鹅卵石外观和深色的单层膜，RPE的mRNA和蛋白标记物高表达。分化后期加入纤溶酶即可迅速降解纤维蛋白支持物，获得完整的RPE单层。该操作方便并且不良反应少[43]。

4.3聚乙二醇/gellan凝胶包埋法gellan凝胶具有良好生物学性状但作为物理凝胶太脆弱，故与聚乙二醇结合起来，从而具备更好的生物相容性、细胞粘附性和细胞生长能力。结果表明细胞在培养全过程中表现出更强的生长分化能力，RPE标记基因的表达也受到正向影响，最终促进视网膜再生。综上，聚乙二醇/gellan凝胶可作为视网膜再生的替代物[44]。

5小结与展望

诱导分化技术不断成熟，但如何同时解决效率、周期、成本的问题仍为目前的争议。自发诱导法费时长且耗资源。二维培养法不能模拟体内胚胎发育过程，但三维法能在体外使细胞历经视杯结构发育过程，从而得到更接近原代分离RPE细胞，不过色素灶出现的更晚并且数量减少。细胞因子法直接作用于视网膜细胞分化的信号通路显著提高分化效率并缩短培养时间，但步骤繁琐成本高，培养需要多次手工传代，致细胞老化。共培养法模拟体内视网膜细胞生长环境，创造分化环境影响ESCs的分化，优化培养质量，但效率则明显下降。

如今，针对视网膜变性疾病多是对症治疗，神经细胞保护药物以及营养支持用以延缓病程进展，治疗并发症，但无法修复已受损的RPE细胞等，干细胞移植则将特定功能细胞整合入视网膜，重建患者视功能，随着干细胞分化培养及移植治疗的新策略不断涌现，该方法取得的成果给广大患者带来了重见光明的希望。但目前的研究仍存在许多争议待解决，分化的具体流程能否做到在保证质量与效率的条件下精确至以天为时间单位指导操作步骤；是否需要精确标准来评估细胞功能及免疫排斥问题；胚胎干细胞源自胚胎，相关治疗时必然会涉及道德、伦理甚至政治问题；不同干细胞系来源的视网膜细胞存在基因组或表观遗传学差异,导致干细胞源性RPE细胞移植的长久有效安全性尚需进一步研究。