病毒性角膜内皮炎的研究现状

李燕玲，苏旺铭，何小辉

0引言

病毒性角膜内皮炎是一种发生于角膜内皮的急性非化脓性炎症，以特征性的基质水肿，而无基质浸润及新生血管，仅出现于基质水肿区的角膜后沉着物(keratic precipitates,KP)为特征，常伴小梁网炎、虹膜睫状体炎，其临床表现复杂多样，临床误诊率高。1982年首次报道2例以来，病毒性角膜内皮炎逐渐受到人们的重视，国内外均有越来越多的报道。现将其研究现状作一概述。

1病毒性角膜内皮炎的诱因和病因及发病机制

1.1病毒性角膜内皮炎的诱因Shimomura[1]通过一项研究发现压力尤其春夏季时、缺乏睡眠、肩部僵硬不适、身体的疲劳是诱发单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)激活的关键因素，此外还包括暴露于紫外线辐射、月经期、发烧、滥用糖皮质激素和外伤[2]，国外一些研究证明单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)的发生率在老年人更高[3-4]，故认为年龄可能也是发生病毒性角膜内皮炎的一个危险因素。

1.2病毒性角膜内皮炎的病因1985年，Robin等[5]首次在进展性角膜内皮炎患者的房水中分离出HSV，并使用免疫荧光技术在前房细胞中检测到了HSV-1型抗原。2002年Madhavan等[6]从1例双眼角膜内皮炎患者房水中分离出水疱样病毒。有学者[7-9]在2009、2010、2011年利用实时PCR检测出水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)、人类疱疹病毒-7(human herpes virus-7,HHV-7)、人类疱疹病毒-8(human herpes virus-7,HHV-8)，病毒性角膜内皮炎可由多种病毒引起，而HSV-1是最常见的致病病毒。

1.3病毒性角膜内皮炎的发病机制病毒性角膜内皮炎的发病机制存在两大学说：病毒感染学说和免疫炎症学说。相继在患者房水中检测出HSV-1、水疱样病毒、流行性腮腺炎病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、VZV、HHV-7、HHV-8的DNA，至此发现病毒感染可能是病毒性角膜内皮炎的重要发病机制。2002年Zheng等[10]通过在兔的角膜上成功建立了HSV角膜内皮炎的模型，也揭示了HSV-1感染角膜内皮至少是角膜内皮炎的一个病因，前房相关性免疫偏离(anterior chamber-associated im mune deviation， ACAID)在病毒性角膜内皮炎中扮演一个关键性的角色。ACAID指眼源性抗原信号通过眼局部的抗原递呈细胞经血到达脾脏时，选择性地激活调节性 T 细胞抑制抗原特异性的迟发型超敏反应和补体结合性抗体的发生发展，保留抗原特异性致敏的细胞毒T淋巴细胞反应。 而一些体外试验证明了TOLL样受体-9引起的分子反应和调节性T细胞在病毒性角膜内皮炎中也发挥重要作用[11-12]。目前主流观点认为病毒性角膜内皮炎是由病毒感染和病毒诱发的迟发型超敏反应共同作用的结果[13-14]。

2病毒性角膜内皮炎的临床表现及分类

2.1病毒性角膜内皮炎的临床表现病毒性角膜内皮炎表现为视力显著下降，结膜睫状充血或混合性充血，可有角膜上皮小水泡，角膜基质呈局限性或弥漫性水肿，而无基质浸润及新生血管，KP呈尘状、灰白色，脂状或色素样，呈特征性分布，仅出现于水肿区，后弹力层皱褶，部分患者前房闪辉，伴发小梁网炎时可有眼压升高，但常低于40mmHg，反复发作导致角膜内皮失代偿时可发生角膜大泡。由于临床表现复杂多样，常被误诊为急性闭角型青光眼、虹膜睫状体炎、青光眼睫状体炎综合征、免疫性基质型角膜炎以及内眼手术特别是白内障手术后的内皮损伤。

2.2病毒性角膜内皮炎的分类国内外关于病毒性角膜内皮炎的分类多种多样，目前较统一的分类是根据KP的分布情况将其分为盘状型、弥漫型及线状型三类[15]。线状型临床上较少见，其内皮细胞快速大量丢失，是最严重的类型，其KP类似角膜内皮排斥线，呈线状排列，向心性发展，KP 和角膜缘之间有基质和上皮水肿，KP线内外角膜水肿边界清晰，线状型角膜内皮炎可单独发生于穿透性角膜移植术后或白内障术后，引起的病原体通常有HSV和CMV。当KP呈钱币样排列时是CMV角膜内皮炎的特征性改变。盘状型是最常见的类型，角膜中央或旁中央呈圆形或盘状基质水肿，边界清晰，明显划分出感染区和非感染区，水肿区有大量KP,引起的病原体通常有HSV和VZV，角膜内皮细胞丢失不明显。弥漫型相对较少见，通常出现于流行性腮腺炎病毒全身感染时，角膜弥漫性水肿，KP也弥漫性分布，当角膜内皮细胞密度下降到一定程度时，角膜水肿也在几周内消失，此型机制尚不明确，可能是病毒血症时病毒进入前房有关[16]。

3病毒性角膜内皮炎的辅助诊断技术

3.1病毒分离病毒分离法曾为诊断病毒感染的“金标准”，但检出率较低，花费时间长，其对标本运输、细胞培养及实验室设备要求较高，而且当病毒处于潜伏期，未进行复制时，可造成假阴性的结果。在临床上无法推广，只能在有条件的医院或实验室开展。

3.2角膜内皮镜检查病毒性角膜内皮炎时角膜内皮细胞表现为体积普遍增大、数目减少、大小不等、细胞边界不清、六边形细胞比例减少、细胞呈多形性、形态不规则[17-18]。陈凯等[19]通过对各型角膜内皮炎药物治疗前后内皮细胞的观察发现盘状型、线状型、弥漫型内皮细胞损伤程度不同，需要药物治疗的时间、恢复时间不同，弥漫型内皮细胞损伤最为严重，需要恢复的时间最长。

角膜内皮镜检测可观察内皮细胞形态改变，可判断内皮损伤严重程度，以及观察治疗前后病情恢复情况，但是缺乏特异性，多种疾病有共同表现，因此无法明确病因，只能作为一种辅助检查方法。

3.3活体共聚焦显微镜病毒性角膜内皮炎活体角膜共聚焦显微镜下(invivoconfocal microscope, IVCM)表现为病变区角膜上皮细胞肿胀，细胞间出现大小不一的空泡，上皮下神经纤维丛密度下降，纤维变细，基质层可见树突状的朗格汉斯细胞聚集，基质细胞肿胀，活化，初发者基质内无炎症细胞浸润，无瘢痕，而病情迁延者基质层可见炎症细胞浸润甚至瘢痕形成，内皮细胞不同程度肿胀，失去多边形结构，边界模糊，核增大，细胞间隙增宽，出现形态各异的KP。内皮炎时角膜各层均发生变化。经过治疗后角膜上皮细胞可恢复正常，上皮下神经纤维丛密度仍较低，基质层朗格汉斯细胞密度下降但仍比健眼高，仍表现为树突样，角膜基质细胞肿胀减轻，炎症细胞减少，内皮细胞形态逐渐恢复正常，KP吸收后内皮细胞覆盖原来缺损区域[20-22]。Hillenaar等[23]也观察到类似表现，其还发现经过1～3wk的治疗，内皮细胞肿胀、边界不清、炎症细胞浸润等体征均可以消失，但是内皮细胞数却每年都在下降，以每年10.3%的速度在下降，内皮细胞发生了不可逆的反应。

跟裂隙灯的40倍的分辨率比起来，IVCM的500倍的分辨率可以观察到裂隙灯无法观察到的细胞形态改变，比如细胞间间隙扩大，内皮层炎症细胞浸润，细胞边界不清，点状空洞，内皮缺失等，其可以早期发现疾病，通过细胞水平的观察，为临床探讨，治疗及转归提供形态学依据，观察治疗效果，通过检测形态学改变，把握临床治疗时间。共焦显微镜检查对于HSK的诊断无特异性，在临床上仅作辅助检查。

3.4环媒恒温扩增法环媒恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)由Notomi于2000年研发，是一种新式的恒温核酸扩增方法，与病毒培养相比，LAMP的敏感性较高；与RT-PCR相比，LAMP的敏感性较低。

3.5间接免疫荧光法间接免疫荧光法(indirect immuno fluorescent technique，IIF)是组织化学和免疫学方法结合而成的一种比较灵敏的检测方法， 主要借助显微镜检查来观察抗原-抗体反应。国内外均有学者利用此技术检测出病毒性角膜炎中的病毒，Kaufman等[24]利用IIF与病毒分离两种方法来检测病毒性角膜炎患者中的病毒，检测结果相符，证明了IIF检测病毒的可行性。王怡等[25]利用间接免疫荧光技术在角膜内皮炎的患者房水及小梁组织中检测出了HSV-1病毒。

3.6 PCR、RT-PCR、巢式PCR、多重PCRPCR是基于DNA的复制原理在体外对病毒DNA进行扩增，通过技术改进，又产生了RT-PCR、巢式PCR、多重PCR。多重PCR可早期、快速检测出多种病原体，敏感性高，其最小检出量为100fg DNA，相当于几十个拷贝的HSV或十几个真菌。但是多重PCR设计引物较困难，目前运用最广泛的病原学检测技术是RT-PCR，张爱雪等[26]证明了RT-PCR技术的高敏感性、高特异性和高精确性，其在疾病诊断、预后监测等方面有着广泛的应用前景。Inoue 等[27]利用实时PCR在角膜内皮炎中检测出HSV、CMV、VZV、HHV-7及HHV-8。其还利用RT-PCR检测出了在治疗前和治疗后的HSK病毒DNA拷贝数的变化由此发现治疗是否有效，而且还发现了阿昔洛韦耐药病毒株。因此在临床上运用抗病毒药物无效时可用此法检测，来判断是否耐药，从而及时更换治疗方案。PCR检查还对潜伏在角膜组织中的病毒的检出具有较高的灵敏度[28]。

IIF、PCR及其改进技术用于病毒角膜内皮炎中检测病毒具有高敏感性、高特异性，但是其设备昂贵、需要专业技术，价格较高，在临床上运用具有一定限制性，故主要用于实验室研究。目前对于病毒性角膜内皮炎的诊断还主要依靠临床观察。

4病毒性角膜内皮炎的治疗

4.1临床主要治疗方法根据病毒性角膜内皮炎的发病机制，目前国内外较统一的观点是抗病毒治疗和糖皮质激素联合运用，在临床上，联合用药疗效确切[18,28-30]。国内外专家均认为抗病毒为治疗的第一要素，只有在足量抗病毒的前提下联合应用适量激素才可迅速控制病情[31-32]。

抗病毒药物中阿昔洛韦(acyclovir，ACV)是最早应用于临床，抗病毒疗效最好的药物之一。而ACV对正常细胞毒性小，特异性高。目前，ACV仍为抗单纯疱疹病毒首选药物，静脉滴注时常采用阿昔洛韦。伐昔洛韦是阿昔洛韦的前体物质，可在小肠迅速转化为阿昔洛韦，生物利用度是后者的5倍，许多实验也证明口服伐昔洛韦比口服阿昔洛韦安全性有效性更强[33]。故口服抗病毒药物时常用伐昔洛韦。更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)是ACV的一个同族体 ，出于安全性、有效性、耐受性考虑，0.15%更昔洛韦凝胶现在认为是局部抗病毒药物的一线用药，局部运用更昔洛韦凝胶或滴眼液在角膜和前房能达到有效治疗剂量[34]。

关于病毒性角膜内皮炎治疗中运用激素的问题，洪晶[35]认为中重度病毒性角膜内皮炎可局部使用糖皮质激素，重度盘状型、弥漫型及所有线状型需全身运用，在药物治疗过程中，研究发现对内皮炎患者延期应用糖皮质激素会加重角膜内皮细胞的丢失。因此，早期应用皮质类固醇激素可减少内皮细胞的丢失，及时控制病情发展。邓世靖等[20]通过共聚焦显微镜观察到角膜内皮炎时内皮细胞间有形态各异的炎症细胞的聚集和浸润，初发或病程较短的病例，基质层未见炎症细胞浸润，经及时治疗，角膜可无明显瘢痕形成；但反复发作，或病情迁延的患者，炎症可波及角膜基质，至基质内出现多量炎症细胞浸润，可见瘢痕形成，临床上表现为内皮型和基质型的混合类型。因此早期迅速控制炎症至关重要。

史伟云[31]推荐阿昔洛韦静脉滴注7～10d后改口服抗病毒药3mo以上，局部抗病毒药至少1mo，应逐渐减量至停药，糖皮质激素在炎症消退后应停药，一般不超过4wk。洪晶等[29]则认为激素应使用1mo以上，线性角膜内皮炎激素类药物使用时间不能少于3mo，但两者均推荐在炎症反应控制后还要使用一段时间的维持剂量药物。Basak 等[36]推荐口服及局部抗病毒药物1a或更长时间对预防复发是有用的。

4.2其他治疗方法及研究现状

4.2.1其他抗病毒药物Brincidofovir(CMX001)是作为一种活跃的、亲脂的西多福韦(CDV)形式发展而来的抗病毒药物,以改善 CDV 的口服生物利用度在病毒感染的细中,CMX001 代谢释放 CDV,抑制病毒 DNA 聚合酶,进而抑制病毒复制[37]。

4.2.2前房和玻璃体腔注射抗病毒药物Choi等[38]成功利用前房GCV注射来治疗严重CMV内皮炎的患者，第一个证明了GCV前房注射治疗病毒性角膜内皮炎是可靠的、安全的。同时其发现GCV对角膜内皮细胞的毒性作用具有浓度依赖性，当GCV浓度大于5mg/mL时，细胞密度下降，抑制了细胞增殖，而当浓度小于0.5mg/mL则不会降低内皮细胞密度，是安全、可靠的。前房注射抗病毒药物比全身用药副作用较少，对于有严重药物副作用的病毒性角膜内皮炎的患者，此方法也是一个很好的选择。利用玻璃体腔注射也被证明能有效治疗CMV角膜内皮炎的患者[39]。相对于玻璃体腔注射，前房注射可能更有优势，其药物可迅速抵达角膜内皮发挥作用。

4.2.3 基因治疗在美国，每年有59万的新发病例，其中25%～42%的患者初次发病1～2a间又复发。Young等[40]报道341初次感染HSV者1、5、10、20a复发率分别为27%、50%、57%、63%，有复发史者复发率则更高。HSK的复发除了因HSV-1的再活化外，还可能重新感染了新亚型HSV，Remeijer等[41]发现三分之一的复发疾病是角膜二次感染了HSV-1的新亚型，其中有63%的亚型是相同的。有HSK复发病史的血清阳性个体可能具有CC IL28B基因型。这种基因型可能与感染控制不完全以及三叉神经节第一神经支上周期性病毒脱落更为频繁有关，临床上表现为复发性疱疹性角膜炎。复发性HSV-1感染的临床表现似乎受IL28B基因型多态性的影响[42]。此外HSV-1对治疗药物(多为阿昔洛韦)产生耐药 也可能是引发HSV-1再次感染的原因之一。阿昔洛韦为抗病毒的一线药物，而临床及实验室不断发现对阿昔洛韦耐药的病例[43]。患有HSK比患有HSV-1相关的其他疾病相比对ACV耐药更高[44-45]，报告显示，阿昔洛韦在角膜的耐药性高达6%[46]，耐药的病毒性角膜炎在其病毒潜伏期过后再次被激活时仍然耐药[47]。全身抗病毒药物耐药性高，局部耐药较全身用药小，但局部用药的眼表停留时间短，导致局部用药效果差，Koganti 等[45]研究了一种新方法，将阿昔洛韦通过碳基药物传递系统也就是药物封装碳(drug-encapsulated carbon，DECON)，可以增加局部阿昔洛韦的疗效。DECON是一种无毒黏合剂。它装载大量的药物并运送到角结膜，以一种持续的方式附着在黏膜表面，使其成为传统给药的一种新选择。

目前的治疗药物大多是作用在抑制病毒DNA聚合酶，对于耐药的HSV感染，目前的抗病毒二线药物有膦甲酸钠和西多福韦，但药物毒性大，临床很少用。长期口服阿昔洛韦及类似物等可预防复发，但其并不能根除潜伏感染的病毒[48]。这就需要开发新药，来阻止复发和耐药，从而更好地预防和治疗病毒性角膜内皮炎。

4.2.3.1疫苗我国朱明昭等[49]构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗，免疫小鼠后，产生了特异性抗体，发现HSV-IgD重组质粒DNA有可能作为HSV-1的DNA疫苗。刘晓娟等[50]研究了白介素2(IL-2)cDNA协同HSV-1 gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响，证明IL-2作为一种新型的免疫调节因子基因佐剂在抗HSV-1感染免疫中具有良好的应用前景。

Bettahi等[51]用自身辅助的糖蛋白D脂肽免疫小鼠，可以预防小鼠病毒性角膜炎的发生，接种疫苗的小鼠的泪液中病毒的滴度减少，但HSV-1 CD4 T细胞增殖和细胞因子却增加了。Schrimpf等[52]通过敲除感染细胞蛋白(infected cell protein 8，ICP8)基因、病毒宿主关闭蛋白增强了疫苗的效能，降低角膜炎的发生率。在小鼠的试验中学者证明了CJ83193可作为有效地防止HSV-1感染的疫苗[53]。Lu等[54]证明了 CJ9-gD可以让UL9基因缺失，编码额外的gD基因，感染后高表达gD，相对于CJ83193可以产生更多的抗HSV-1的特定中和抗体，防止野生型HSV-1病毒株感染，而且它免疫的小鼠产生更强的T细胞反应，阻止了80%的野生型病毒的潜伏感染。

4.2.3.2抗体2013年，Koganti等[45]开发了一种人源化单克隆抗体，命名为mAb hu2c，是一种病毒糖蛋白gB的抗体。mAb hu2c被证明能够有效中和HSV-1的野生型和耐药株，它阻断了病毒在细胞间的传播。

4.2.3.3解旋-引物酶抑制剂解旋-引物酶对于病毒复制是必不可少的，解旋-引物酶抑制剂是以包含了UL5、 UL8和 UL52的解旋-引物酶复合体为靶点，在动物模型上证实了其可有效控制病毒HSV感染[55]，这给病毒性角膜内皮炎的治疗带来希望。

4.2.3.4趋化因子受体传统的药物治疗都是针对病毒酶的药物，所有可用药物控制的病毒蛋白和相关小分子不多，是有限的，而这些起直接作用的药物的主要使用缺点是耐药性的出现[56-57]。这就使人们去发展宿主导向分子[58]，Shimomura[1]通过在小鼠HSK模型上使用了8种趋化因子，发现这些趋化因子可以打开HSV的包膜，证明了其可以抑制HSV的感染。近年来基础及药物研究正在往病毒-宿主相互作用的网络中的蛋白为靶点的方向发展，FDA批准了一个成功的抗病毒药物是马拉韦罗，是CCR5趋化因子受体，用来治疗HIV感染[59]。相信近来比较热门的VH protein-protein interactions (PPIs)的研究会对探索宿主导向药物提供新方向。

4.2.3.5其它方法BX795是一种著名的PDK1抑制剂，其能抑制下游许多其他激酶包括TBK1、B激酶和IkB激酶(IKK)。与目前许多治疗眼部HSV-1感染的方法不同，它不是核苷类似物。相反，BX795可以抑制Akt在Ser473位点的磷酸化并阻止其下游真核生物翻译起始因子4e结合蛋白1的过磷酸化(4E-BP1)。Akt信号通路的激活随后mTORC1的激活被证明可以增加病毒蛋白的合成，因此抑制该途径是抑制细胞内病毒活动的有效途径[45]。

目前基因治疗还只是在动物模型上，分为以炎症介质为靶点的基因治疗和以病毒基因为靶点的基因治疗，但在不久的将来相信在人的身上可以实现，更好地治疗和预防病毒性角膜内皮炎。

5展望

对于病毒性角膜内皮炎发病机制，未来有望能更清楚地了解，实验室病原学检测技术的提高若能在临床上广泛推广，则可避免延误诊断，耐药病毒株的出现及高复发率，急需研究新药，基因工程药物的研究目前尚处于实验室研究阶段，在不久的将来有望在临床上推广，从而给更多病毒性角膜内皮炎患者带去曙光。