抗新城疫-禽流感二联卵黄抗体冻干粉剂的制备及应用

2020-03-03 13:35钱景富贺永明杨柏松王雅华
辽宁农业职业技术学院学报 2020年2期
关键词:冻干粉二联新城疫

钱景富,贺永明,杨柏松,王 晶,王雅华,*

(1.辽宁农业职业技术学院,辽宁 营口 115009;2.辽源市东丰县东丰镇畜牧站,吉林 辽源 136300;3.青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266032)

鸡新城疫(ND)和禽流感(AI)仍是制约我国养鸡行业健康发展的主要传染病,常以单独或混合感染的方式感染家禽,发病率和死亡率都很高,对养鸡业危害严重。目前对这两种传染病尚无有效药物治疗,采取被动免疫是一种有效的措施,我国已有卵黄抗体(IY)上市,对防治ND和AI发挥了重要作用。现有的商品化IgY主要是液体制剂,通过注射方法使用,注射时鸡群易受到抓鸡惊吓导致应激综合症,连续注射针头更换不及时也易造成交叉感染导致疾病传播,同时免疫注射工作量大,费时费力,劳动力成本增加,如果操作不正确,会造成注射部位感染化脓、产生肿块、形成肉瘤、造成跛行等等,甚至会引起死亡。因此本研究在IgY剂型、使用途径上进行创新研究,制备IgY冻干粉剂,通过拌料或者饮水方式免疫,更适合现代规模化鸡场使用,减少免疫注射带来的弊端。为此我们进行了抗新城疫-禽流感(H5、H7、H9)多价二联卵黄抗体冻干粉剂的研制及口服应用试验。

1 试验材料

1.1 试验动物

20日龄健康雏鸡10只,要求新城疫和禽流感HI效价均小于3lg2;100日龄鸡新城疫和禽流感免疫健康蛋鸡80只。

1.2 免疫疫苗

新城疫一禽流感H9亚型二联灭活苗、重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株),均购自市场上正规流通合格产品。

1.3 主要试剂

鸡新城疫血凝抑制试验(HI)标准抗原和标准阳性血清、禽流感H9亚型HI标准抗原和标准阳性血清、禽流感H7亚型HI标准抗原和标准阳性血清(H7N9 H7-Re1株)、禽流感H5亚型HI标准抗原和标准阳性血清(Re-8株)、生理盐水、l%红细胞悬液、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、酪胨琼脂(G.A)、葡萄糖蛋白胨汤(G.P)、正辛酸、甲醛、吐温-80等。

2 试验方法

2.1 强化免疫

对免疫蛋鸡群进行3次加强免疫。每隔2周进行1次强化免疫,免疫疫苗为新城疫一禽流感H9亚型二联灭活苗和重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株),肌肉注射。

2.2 抗体效价检测

第3次免疫后7 d收集卵黄,通过HI检测ND与AI卵黄抗体效价,当新城疫和禽流感H9亚型抗体效价达12lg2、禽流感H7亚型(H7N9 H7-Re1株)和禽流感H5亚型(Re-8株)抗体效价均在10lg2及以上开始收集高免鸡蛋。

2.3 卵黄抗体制备

2.3.1 收集卵黄

将合格的高免蛋用清水洗净,然后置0.1%新洁尔灭溶液中浸泡15 min,取出晾干。除去蛋清和系带,收集蛋黄,充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状。

2.3.2 萃取

将收集的卵黄加入8倍体积的PH4.2的注射用水,搅拌混匀后,4~8℃静置24h,低温离心分离上清液,收集于灭菌容器中。

2.3.3 灭活

将收集的上清液,加入辛酸至终浓度为0.02%,搅拌混匀,室温放置2~4h灭活。最后按终浓度为0.05%加入甲醛溶液,充分搅拌混匀,室温密封24h,再次灭活。

2.3.4 除菌过滤

用0.22μm微孔滤器过滤除菌。

2.3.5 冷冻干燥

加入吐温-80和蔗糖作为稳定剂,放入冷冻真空干燥机进行冻干。

2.4 卵黄抗体质量检验

2.4.1 物理性状

白色微黄色干粉。

2.4.2 无菌检验

在无菌条件下进行,将卵黄抗体冻干粉稀释10倍,取1mL接种于T.G培养基小瓶,37℃培养,3 d后移植T.G、G.A小管各2支,每支0.2 mL,置37℃、25℃各一支;再取样品0.2 mL直接接种G.P小管1支,置25℃。均培养5 d。观察是否有细菌生长。

2.4.3 安全检查

用20日龄健康易感雏鸡10只,每只鸡口服10个使用剂量,观察2周。观察雏鸡精神状态和死亡情况。

2.4.4 效力检验

用HI检测鸡新城疫和禽流感抗体效价。

2.5 抗体粉临床应用效果观察

将抗新城疫、禽流感(H5、H7、H9)多价二联卵黄抗体在蛋鸡和肉鸡中进行应用试验,观察其临床效果。

3 试验结果

3.1 卵黄抗体质量检验

3.1.1 无菌检验

鸡新城疫-禽流感二联卵黄抗体接种T.G、G.A和G.P培养基培养,均无细菌生长。

3.1.2 安全检查

口服鸡新城疫-禽流感二联卵黄抗体的雏鸡连续观察2周,未见异常表现,全部健活。

3.1.3 效力检验

ND抗体效价平均为13.75lg2,AIH9抗体效价平均为12.50lg2,AIH7(Re-1株)抗体效价平均为10.25lg2、AIH5(Re-8株)抗体效价平均为10.725lg2。

3.2 抗体临床应用效果

临床应用抗鸡新城疫-禽流感(H5、H7、H9)二联卵黄抗体结果显示,该卵黄抗体对ND和AI防治效果显著。治疗时采用饮水方式添加,发病早期使用二联卵黄抗体后可控制感染鸡群不再发病;发病中期,使用抗体治疗1次感染鸡群死亡率得到控制,连续使用2次抗体治疗,第4 d基本痊愈;发病晚期鸡群使用卵黄抗体治疗效果不明显。治疗使用剂量雏鸡每只鸡0.10g~0.15g,青年鸡每只鸡0.15g~0.20g,体重在2.5 kg以上的鸡使用剂量为0.20g~0.25g;紧急预防采用拌料方式添加,根据体重每只鸡使用剂量在0.10g~0.20g之间,使用1次抗体即可,还要进行疫苗接种,产生主动免疫。

4 结论与讨论

本试验结果表明,使用抗新城疫、禽流感(H5、H7、H9)多价二联卵黄抗体对ND和AI的预防保护率达到95%以上,发病初期治愈率可达到95%以上,发病中期治愈率80%~90%之间,晚期效果不理想,说明越早应用抗体效果越好。本研究通过饮水或拌料方式使用IgY防治ND、AI效果理想,即节省人力,又减少注射和抓鸡造成的应激反应。IgY与一般哺乳动物IgG相比,IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力[1],IgY对消化酶具有一定的抵抗作用,因此适合在饲料和饮水中添加使用[2]。抗体具有中和相应病原体的特性,适时给机体输入抗体,可使易感动物的病毒感染呈现预防乃至治疗作用[3]。进入肠道的IgY可直接中和鸡新城疫病毒和禽流感病毒,使病毒不能黏附和进入肠道黏膜上皮细胞,导致病毒不能大量复制,起到预防作用。抗体也能透过毛细血管壁,分布于细胞外液和血流中,可中和体内细胞外液病毒,起到治疗作用,有研究表明:IgY在肠道消化酶作用下,降解为Fab和F c片段,可变小Fab部分很容易被肠道吸收,进入机体后能与相应的病原菌黏附因子结合,使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性,而IgY的稳定区F c部留在肠内[4]。但是IgY应用属于被动免疫,见效快,无任何毒副作用,缺点是维持时间短,因此,临床IgY多用于治疗或者紧急预防接种,鸡群仍然需要疫苗免疫,一般是使用抗体7 d后再用疫苗人工主动免疫[5]。

由于食品安全、耐药性问题,“无抗日粮、减抗养殖”是养殖业必然发展趋势,目前欧盟及我国已禁在饲料中添加抗生素,利用非药物添加剂替代抗生素已成为必然趋势[6-7]。IgY因具有零副作用、低成本、耐热性和较高的抵抗力,加之采集方便以及不受地域 限制等优点,在动物疫病的预防和治疗的过程中必将发挥重要的功效,具有非常大的使用价值。

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