MALDI-TOF MS用于碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌同源性分析的临床应用

宋江勤

天门市第一人民医院，湖北 天门 431700

当前院内感染防控中，进行同源性分析至关重要，常用同源性分析技术中脉冲场凝胶电泳技术为当前病原菌分子分型时的金标准，具有分辨力强等优点[1]。MALDITOF MS为新型技术，本文为研究其临床应用价值，收集我院50株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌进行同源性分析，详情如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料 以我院2019.1-2019.12自50例患者分离出的50株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌为研究标本，其中24株来自ICU患者，26株来自其他科室患者。

1.2 方法 仪器采用vitek Ms质谱仪。脉冲场凝胶电泳方法为：将此50株菌株接种于血平板，于37℃环境培养18h，选取其中菌落溶在细胞悬液缓冲液内，完成菌体悬浮，制备4个麦氏浊度菌悬液，后续加入400ul菌液与蛋白酶K溶液20ul混合均匀，加入浓度为1%的琼脂糖溶液400ul，迅速注入模具，室温静置10min，凝固后混合液内（25ul蛋白酶K+5mL细胞裂解液），54℃水浴摇床进行裂解，持续2h，在以50℃纯净水及TE水浴摇床洗涤，取宽度为2mm胶块置入200ul缓冲体系离心管，10min后加入200ul酶切体系，水浴酶切后进行脉冲场电泳。MALDI-TOF MS：菌株接种后，置于37℃培养箱内，调控二氧化碳浓度至5%，持续培养18h，取适量细菌置入15mL的Eppendorf管内，加纯水混匀，水量300ul，加无水乙醇900ul混匀，以13000r/min转速离心2min，去上清液再加甲酸混匀，甲酸浓度为70%，液量50ul，再加乙腈，液量50ul，混合均匀再离心2min，取上清液至样品靶板，自行晾干后滴1ul基质溶液。

2 结果

2.1 脉冲场凝胶电泳 本次研究中50株菌株有A、B、C、D、E，5种脉冲带型，其中A型共计23株，均为ICU病室分离所得，其内21株无明显条带差别，另有2株同此21株存在条带差别，B型有5株、C型6株、D型8株、E型7株。

2.2 MALDI-TOF MS 本次MALDI-TOF MS同源性分析中，50株菌株被分为Ⅰ类、Ⅱ类，其中Ⅰ类24株，均为ICU病室分离所得，其中21株在三维散点图中空间位置较为接近，推断其亲缘关系较近，疑似为同一菌株来源。

3 讨论

肺炎克雷伯菌属于院内感染常见致病菌，其感染部位较多，如呼吸道、尿道、腹腔等均为常见感染部位，感染后若未及时控制，可进一步引起败血症、脑膜炎等危重并发症[2]。

近年来广谱抗菌药物的不断研发及应用，一方面虽提高了临床感染疾病防治效果同时也导致各类病原菌耐药性增加，临床碳青霉烯类药物的滥用，致使碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的数量明显增多[3]。

MALDI-TOF MS为当前应用较多的微生物鉴定技术，在进行菌株鉴定时，还可利用软件完成同源性分析，为医院感染控制提供可靠实验室依据[4]。实际应用中其可进行主成分分析及聚类分析，在几分钟内即可完成同源性分析，具有通量高、方便、成本低等优点。与当前微生物鉴定金标准的脉冲场凝胶电泳对比，在碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌同源性分析效果基本一致。本次两种技术在50株菌株的同源性分析中，对ICU病室分离的菌株的同源性分析结果无明显差别。

综上所述，MALDI-TOF MS用于碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌同源分析具较高应用价值，可积极推广。