激光破膜软件评估卵母细胞受精及妊娠结局的作用研究

刘春莲,吴 昕,胡 蓉,王飞苗,裴利国,宋晓霞,张 倩,徐 仙

客观地评估卵母细胞质量是人类辅助生殖技术(ART)研究中的重要内容，目前临床上根据卵子形态、极体以及细胞质的指标进行评估，但具有主观性且可预测性仍然有限，因此确定卵母细胞质量客观评价的标准至关重要。本研究利用激光破膜仪器对人卵母细胞进行了定量形态学研究，系统分析了成熟卵母细胞的形态学参数，包括卵母细胞直径、透明带厚度、卵周间隙以及极体直径，监测透明带硬度变化，评估这些形态参数与卵子受精及胚胎发育潜能之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2020年4月-5月在宁夏医科大学总医院生殖医学中心，首次接受自体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕症夫妇，排除标准：① 女性年龄≥38岁或卵巢功能减退者；②男性中、重度少弱畸精子症；③附睾睾丸穿刺周期；④ 供精及赠卵周期。共筛选出158个周期，其中女方年龄22～37岁 (29.4±5.7)岁，男方年龄24～41岁 (32.2±6.3)岁，共获得1 764枚卵母细胞复合物。其中78个周期接受了激光破膜仪器测量作为实验组，80个常规周期作为对照组，该临床实验通过宁夏医科大学总医院生殖医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵及卵母细胞培养：女性患者进入超促排卵周期，利用超声监测卵泡发育，当卵泡直径达到18～20 mm时，给予HCG(UK)，注射后36 h取卵。所有培养液均在37 ℃ 5% CO2的Galaxy S培养箱中平衡，收集的卵母细胞在装有IVF培养基(IVF，Vitrolife，瑞典)的皿中培养，覆盖1.5 ml矿物油(Ovoil-100，Vitrolife，瑞典)，并在培养箱中放置2～4 h，用透明质酸酶(80 U/ml，SAGE体外受精，美国)进行消化，剥除卵母细胞周边的颗粒细胞，利用光学显微镜观察卵母细胞的极体(Polar Body，PB)进行筛选，挑选出未成熟的卵母细胞如生殖小泡(GV)和中期Ⅰ(MⅠ)，将中期Ⅱ(MⅡ)卵母细胞分别置于20μl的微滴中(MOPS Vitrolife，瑞典)，覆盖矿物油后培养15 min，捕获图像进行测量。将卵子和经过密度梯度离心优化后的精子共同培养受精，受精后2～3 h捞出卵子于IVF培养液滴，受精后5～6 h进行再次测量和观察，过夜培养。

1.2.2 卵母细胞定量形态学测定：利用尼康Diaphot-300倒置显微镜对单个卵母细胞进行实时成像，使用激光破膜成像软件(Saturn,RI,英国)，测量卵母细胞直径、透明带厚度、卵周间隙以及胞质直径[1]。选取卵周间隙最宽的部位进行画线，测量卵母细胞的直径和细胞质直径，在该线的对面进行两次透明带(ZP)厚度测量，并取两次测量平均值，卵周膜间隙宽度=卵母细胞总直径-(细胞质直径+透明带厚度)。

1.2.3 卵母细胞透明带硬度测定：测量卵母细胞透明带在受精前、后的厚度，用激光在透明带上打一个孔，能量为14 ms，所有的操作都在覆盖油的培养液滴中，保持热台温度，操作结束迅速放入培养箱中。

2 结果

2.1 2组获卵数、MII获卵率情况比较:本研究中测量组78个周期获得983枚卵母细胞，平均获卵数12个，MII获卵率75%(9/12)，对照组80个周期获得891枚，平均获卵数11个，MII获卵率77%(8.5/11)，与测量组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 测量组MII卵子受精前后的形态参数比较:使用激光破膜仪器测量四条径线，比较MII卵子形态参数受精前后变化发现，受精前后卵母细胞的直径和细胞质直径差异无统计学意义，受精后卵母细胞的透明带较受精前卵母细胞变薄[(15.5±0.4)μm与(13.8±0.4)μm，P<0.05]。此外，与未受精卵母细胞相比，受精卵母细胞卵周间隙的宽度[(6.5±0.4 )μm与(5.2±0.3)μm,P<0.05]缩小，卵子受精后透明带打孔孔径变小(P<0.05)，见表1。

表1 测量组MII卵子受精前后的形态参数比较

2.3 2组IVF实验室数据以及临床结局比较:比较2组患者接受IVF技术助孕过程中的各项指标，发现测量组受精率、优质胚胎率及冷冻胚胎率高于对照组(P<0.05)，而卵子的两原核(2PN)卵裂率、着床率和妊娠率无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 测量组与对照组IVF实验室数据以及临床结局比较[n(%)]

3 讨论

自人类辅助生殖技术应用于临床以来，卵母细胞的质量、形态与胚胎质量的相关性是辅助生殖技术中一个有争议的话题[2-3]，目前临床研究集中在观察细胞质形态学的标志物，如空泡、粗颗粒、折光体[4]和线粒体[5]等，还有研究利用偏振显微镜评估纺锤体的存在和位置，但研究结论尚不一致，如何客观评估卵子质量仍需不断探索出新的方案，本项研究利用激光破膜仪器测量卵母细胞形态参数，评估其对预测受精和临床妊娠结局的作用。

MII卵母细胞的形态包括形状、颜色、细胞质的颗粒状态和均质性、卵周间隙的宽度、卵周间隙碎片、空泡化、第一极体(1st PB)或透明带的异常情况。李楠等发现不同形态的卵母细胞能够预测胚胎发育的潜能[6]，有报道显示1PB碎裂表明卵母细胞胞质功能下降[7]，较大的卵周间隙空间导致受精率降低[8]，但有研究证实对极体的非整倍体研究不能客观反映胚胎的染色体情况，因此不能提高胚胎的种植潜能[9]，Weghofer客观指出每个妇女的卵子直径差异较大，接近平均直径的卵母细胞其发育潜能最佳，研究证实卵母细胞直径与体重指数(BMI)及抗缪勒管激素(AMH)(P =0.03)呈负相关，与受精率呈正相关(P =0.008)[10]。肥胖妇女卵子胞质直径与妊娠呈负相关，胞质直径较大且透明带厚度较薄的卵子其妊娠结局越好[11]，卵周间隙较窄且透明带不均质的卵子的两原核(2PN)率、受精率以及妊娠率均下降，选择卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)是可行的助孕方式[12]。研究发现直径较小的卵母细胞减数分裂成熟受到抑制，可能是由于细胞大小依赖性检查点或缺乏减数分裂所需的物质导致，也就是说在卵母细胞生长的最后阶段，需要提供发育潜能的物质，如增加卵母细胞的大小，卵母细胞与透明带(ZP)内表面的连接增加了，极体排出和卵母细胞减数分裂恢复使卵母细胞体积变小。Azita认为卵母细胞直径可用作预测胚胎卵裂时间的标志[13]，本研究回顾性地分析了MII卵母细胞的形态学参数对受精和妊娠结局的预测价值，与没有进行测量的周期相比，卵母细胞及胞质直径在受精前后无统计学差异，该结论和Romao研究一致[14]，但透明带和卵周间隙直径在受精后小于受精前，具有统计学差异(P<0.05)，卵泡成熟过程中形成的透明带的晶体网络结构呈现最佳的有序结构，相反“无序”的透明带结构的卵子发育潜能较差。因此推测透明带的正常结构完整性可能反映卵母细胞及其各种细胞的最佳发育潜能和分子结构，透明带反应较好的卵母细胞具有最佳发育植入能力；研究表明利用激光在2细胞期、桑葚胚以及囊胚期透明带减薄术以及打孔术对胚胎发育和孵化没有负面作用[15]。本研究通过监测激光打孔的直径作为间接评估透明带厚度的指标，直径越小，表明透明带厚度越硬，透明质酸酶不影响透明带厚度和结构，受精后的透明带变硬，阻止多精受精发生，保护胚胎不受外界影响并便于在输卵管运输到达子宫着床。

常规短时受精后，通过判断2PB的出现评判受精与否，具有一定主观性，易出现判读失误，导致受精率下降或过度补救，而常规方法结合激光破膜仪监测指标可提高判断准确性，从而提高受精率、优质胚胎率、可移植胚胎率以及胚胎冷冻率，成为临床上可供选择的方法。