丙泊酚对创伤性脑损伤大鼠神经细胞自噬的影响

王春生，沈 燕

创伤性脑损伤(TBI)是目前全世界一个重要医学难题，其病死率及致残率在意外事故中最高，是成人死亡或永久残疾的重要原因之一[1-2]。TBI包含原发性损伤和继发性损伤两个部分，原发性损伤是决定患者预后的主要因素，但临床上难以干预，而对于继发性损伤的治疗尚无特效药物。大量研究表明[3-4]，自噬在大脑细胞稳态的维持中起着至关重要的作用，在各种急性脑损伤(包括TBI、脑卒中、癫痫发作等)中均能检测到自噬的发生[5]。国外文献报道[6]，在创伤性脊髓/脑损伤动物模型实验中，通过刺激自噬能够起到神经保护的作用。丙泊酚是目前临床应用广泛的麻醉诱导和维持以及重症监护病房镇静药物。动物实验研究表明丙泊酚对TBI后脑神经元具有一定保护作用。本研究通过研究丙泊酚对创伤性脑损伤模型大鼠神经元自噬作用的影响，试图阐述丙泊酚对脑神经元保护的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：丙泊酚(北京费森尤斯卡比医药有限公司，批号：国药准字J20130024)；苏木精-伊红(HE)染色液(上海谱振生物科技有限公司，批号：20160219)；免疫大鼠微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体；兔抗大鼠Beclin-1抗体；兔抗大鼠P62抗体；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(瑞士罗氏公司)。

1.2 实验动物：雄性健康SPF级SD大鼠72只，周龄为10～12周，体重300～400 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证号:44007200021086，生产许可证号:SCXK(粤)2016-0002。该动物实验获宁夏医科大学总医院医学伦理委员会批准，批准号为NCT01930339。大鼠饲养及实验条件如下：恒温(温度20～26°C、相对湿度40%～70%)，且持续12 h 昼夜节律，自由进食、饮水。依据随机数字表法将上述72只大鼠分为3组：假手术组、TBI模型对照组、TBI+丙泊酚组，每组各24只，再分为3个亚组，每亚组8只。TBI+丙泊酚组在模型建立完成后，依据200 mg/kg在大鼠腹腔内注入丙泊酚。假手术组及TBI模型对照组按照TBI+丙泊酚组腹腔内注入等量生理盐水。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备：所有大鼠禁食8 h 后，应用2%苯巴比妥按照40 mg/kg经腹腔注射麻醉。剃除头部毛发，皮肤消毒后将头部固定于脑立体定位仪上，切开头皮正中并剥离右侧颅骨骨膜，应用颅骨钻于正中线旁开一直径5 mm骨窗，操作中注意保持硬脑膜完整。TBI模型对照组和TBI+丙泊酚组取一直径为4 mm垫片置于脑表面，用40g砝码由20 cm高处自由落体落下并撞击垫片；假手术组无此步骤。然后所有大鼠用骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。

1.3.2 脑组织形态学检查：术后所有大鼠均继续饲养48 h。禁食8 h，依照动物模型制备相同麻醉方式麻醉大鼠，经心脏注入150 ml生理盐水及250 ml的4%多聚甲醛，待大鼠肢体僵硬后，取出全脑并浸泡在4℃的10%多聚甲醛中固定48 h，经常规乙醇脱水、透明后，用石蜡包埋并行厚度约5 μm切片，常规脱蜡、脱水。应用苏木精-伊红(HE)染色液染色。于光镜下观察脑组织病理改变。

1.3.3 脑组织TUNEL染色检测细胞凋亡情况：大脑皮层组织石蜡切片，脱蜡并应用梯度乙醇水化。加入蛋白酶K工作液处理15 min 使细胞通透，用PBS冲洗2次，加入预先准备好的TUNEL混合液，37 ℃条件下反应15分钟，用PBS冲洗2次。在200倍显微镜下观察皮质神经元细胞凋亡数量，每只大鼠选取三个不同层面，并计算视野中凋亡细胞占细胞总数的百分比(即皮质神经元细胞凋亡率)。

1.3.4 脑组织中Beclin-1蛋白、P62蛋白及微管相关蛋白1轻链3-II/I(LC3-II/I)蛋白比值检测：模型建立后48 h，操作前禁食8 h，麻醉大鼠，断头处死，收集大鼠右侧脑挫伤区的皮层脑组织并制成匀浆。置于离心机中(1 000 r/min)离心10 min，取上清液进一步离心。蛋白质含量用蛋白质分析工具包(Thermo Scientific)进行测定。每个样本取相同量的蛋白质(40 μg)加入到缓冲区中，95 ℃，5 min。然后加到聚丙烯酰胺凝胶的上样孔上。电泳后转膜。脱脂奶粉缓冲液抗原封闭2 h。一抗LC3(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、P62(1∶1 000)、4℃过夜。二抗(1∶5 000)室温下孵育过夜。蛋白质条带曝光后，用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件(美国Media Cybernetics公司)检测蛋白质含量。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织形态学:对比各组大鼠伤后48小时脑组织病理切片形态学发现，假手术组脑组织呈现正常脑组织，无明显异常；TBI模型对照组切片可见其损伤脑组织区结构混乱无序、神经胶质疤痕明显，疤痕组织显著萎缩且可见软化灶；TBI+丙泊酚组损伤脑组织区有神经胶质细胞填充，其间疤痕组织范围及软化灶区域面积与TBI模型对照组对比均较小。

2.2 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况：伤后48 h，显微镜下观察并计算皮质神经元细胞凋亡率，其中假手术组为(9.78±0.69)%、TBI模型对照组为(67.39±2.57)%、TBI+丙泊酚组为(30.73 ±2.06)%。两两比较发现，假手术组显著低于TBI模型对照组及TBI+丙泊酚组，差异具有统计学意义(t=12.374、9.622，P<0.05)。TBI+丙泊酚组显著低于TBI模型对照组，差异具有统计学意义(t=7.365，P<0.05)。

2.3 各组大鼠脑组织中Beclin-1蛋白、P62蛋白及LC3-II/I蛋白比值表达:伤后48 h，TBI模型对照组Beclin-1蛋白、LC3-II/I蛋白比值均较假手术组显著升高，P62蛋白表达较假手术组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；TBI+丙泊酚组Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值均显著低于TBI模型对照组，P62蛋白表达高于TBI模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；TBI+丙泊酚组Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值高于假手术组，P62蛋白表达低于假手术组，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠脑组织中自噬相关蛋白表达情况比较

3 讨论

TBI被认为是临床上最严重的脑损伤形式之一，其所引起的身体残疾及认知功能障碍对患者的预后及生存质量产生严重的威胁[7]。目前普遍认为[8-9]，TBI包含原发性损伤和继发性损伤两个部分，原发性损伤为创伤本身，继发性损伤涉及多种病理生理过程，包括氧化应激、神经炎症、细胞凋亡、自噬等。

丙泊酚是短效静脉麻醉药，属烷基酸类，具有吸收快、静脉输注后不易蓄积、起效快、苏醒完全、不良反应少等特点，目前临床广泛应用于麻醉诱导和维持以及重症监护病房镇静药物。有关该药对神经细胞作用研究发现[10-11]，其具有可调节脑组织内氧分压、颅内压、抑制神经细胞凋亡等多种作用特点，对神经细胞起到一定程度的保护作用。国内学者研究表明[12]，丙泊酚可抑制细胞凋亡，保护缺血再灌注损伤的大鼠神经细胞。还有研究表明[13]，其可以抑制颅脑外伤患者血清炎症因子、改善脑组织氧分压及颅内压，从而保护脑组织。但目前对其保护作用机制尚不完全清楚。本研究采用自由落体砝码撞击SD大鼠，建立TBI模型，通过病理切片形态学观察发现，TBI+丙泊酚组与TBI模型对照组相比大鼠脑组织损伤明显较轻、皮质神经元细胞凋亡率显著降低，提示丙泊酚对TBI大鼠脑组织具有保护作用。与前述国内学者研究结果一致。

文献资料显示[14]，细胞凋亡和自噬是TBI致残或致死的重要病理生理过程。本研究针对细胞凋亡检测发现，与TBI模型对照组比较，TBI+丙泊酚组皮质神经元细胞凋亡率显著降低，提示丙泊酚的应用能够有效抑制细胞凋亡过程。

自噬是细胞内一种高度保守的机制，其主要特征为细胞内形成自噬体或自噬空泡的大量出现，主要功能包括：能有效清除异常细胞内蛋白质或细胞器，在维持细胞稳定性中起到重要作用。既往研究认为[15]，不同分子、途径对自噬的调控可能在TBI中表现出抗氧化应激，抗凋亡和抗炎作用。因此，自噬成为TBI治疗的新靶标。既往有学者对不同TBI建模方式(包括液体冲击损伤、可控皮层撞击等)的观察发现，自噬体的广泛存在，其损伤脑组织中Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值均有升高表现，且其浓度与自噬体的量呈正性相关，而P62蛋白表达水平与自噬程度成反比，提示上述三种蛋白为自噬相关蛋白[16]。本研究通过对上述三种蛋白的半定量检测发现，TBI模型对照组Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值水平最高、P62蛋白表达水平最低，且与TBI+丙泊酚组比较差异显著，提示TBI模型建立后神经细胞的自噬活性显著增加，在应用丙泊酚的大鼠中其自噬活性得到一定程度的抑制，这可能是丙泊酚脑保护作用的机制，具体作用位点仍需进一步研究。

综上所述，丙泊酚对TBI大鼠神经细胞具有一定程度的保护作用，其作用机制包括对受损神经细胞凋亡及自噬的抑制，有效减轻神经细胞损伤。