探讨植物单染色体测序中的假阳性问题

王发明 莫权辉 叶开玉 龚弘娟 刘平平 蒋桥生 齐贝贝 李洁维

摘 要：单细胞测序技术目前虽已广泛应用于人类、动物、微生物等物种的研究，但由于细胞壁的存在，使得该技术在植物上的应用举步维艰。如果能先分离出植物单条染色体，然后再应用单细胞测序技术进行扩增和测序，则可以避免细胞壁的干扰，从而具有重要的应用价值。虽然科研人员一直尝试针对单条植物染色体进行测序，但目前尚未见有成功的报道，也未见有文章对失败的原因进行讨论。该研究以六倍体中国春小麦为材料，针对使用单细胞测序技术进行单染色体扩增过程中出现的假阳性问题进行了探讨，分析了单染色体扩增失败的主要原因，并通过高通量测序技术研究了外源污染的可能来源。结果表明：在对实验器具、耗材、环境污染严格防控的基础上，人体接触可能是造成污染的主要来源;同时，推测单染色体之所以扩增失败可能是因为染色体自身超螺旋状态造成引物难以结合和复制。该研究还针对存在的问题提出了可行性建议，为将来成功进行单染色体测序提供了有益的借鉴。

关键词：单染色体，单细胞测序，外源污染，假阳性，MDA，MALBAC

中图分类号：Q943文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）01-0016-08

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract：Single-cell sequencing technology is widely used in the research of human，animal，microorganism and other species，but it is hard to be applied in plant because of being cell wall. If a single chromosomes can be separated from plant cells and then were used for amplification and sequencing with single-cell sequencing technique，the barrier of plant cell wall will be removed and be of important application value. However，there are to date no claims on the successful application of single chromosome sequencing，and the causes of the failure are poorly understood. The issue of false positives that commonly exist in single chromosome amplification was studied，and the main causes of the failure in single-chromosome amplification were discussed. Besides，the probable sources of exogenous pollution in chromosome amplification were studied with high-throughput sequencing，and human body was proved to be the most probable sources of pollution on the basis of all experimental tools，materials，reagents and spaces being under extremely sterilized treatments. The super helical structures of chromosomes themselves were considered as the primary cause of failure in amplification，as primers were hard to bind to strands of DNA to start replication. Finally，some feasible suggestions were put forward. This study provides beneficial lessons for the successful single-chromosome sequencing in the future.

Key words：single chromosome，single-cell sequencing，exogenous pollution，false positives，multiple displacement amplication （MDA），multiple annealing and looping-based amplication cycles （MALBAC）

单细胞测序技术，是目前生命科学研究的热点技术之一。单细胞测序技术可以在单个细胞水平上，使用极微量模板对基因组、转录组和表观组等进行高通量测序分析，可以获得用常规组织样本无法获得的单个细胞的异质性信息，从而被广泛应用于人类的疾病诊断、癌症的早期检测以及发育生物学、微生物学和神经生物学等方面（Lasken，2007; Navin et al.，2011; Huang et al.，2015）。目前，单细胞全基因组测序普遍使用的技术，包括多重置换扩增技术（multiple displacement amplification，MDA）（Hosono et al.，2003）和基于多次退火环状循环的扩增技术（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）（Zong et al.，2012）。單细胞测序技术目前已广泛应用于人类、动物和微生物等方面的研究，但在植物上的研究应用较少，主要原因是植物存在细胞壁，使用普通方法难以进行分离和裂解。严建兵团队曾发现了一种简单可行的方法，成功分离出玉米小孢子四分体，并使用单细胞测序技术成功进行了全基因组测序，获得了多个创新性的科学发现（Li et al.，2015）。这是单细胞测序技术在植物上的首次成功应用。然而，单细胞测序技术在染色体水平上的应用却尚未见有成功的报道。

植物染色体是植物细胞在有丝分裂或减数分裂时的超螺旋存在形式，是染色质的高级结构，容易分辨和分离。那么，能否利用单细胞测序技术来进行单条植物染色体的体外扩增和测序呢。单细胞测序技术可以对单个微生物细胞进行测序，多数细菌基因组大小不足十兆，远低于很多植物单条染色体的大小，因此利用单细胞测序技术进行植物单染色体测序从理论上是可行的。通过分离染色体进行体外扩增，可以避免细胞壁的干扰，目前虽然已有较多分离单条染色体并进行体外扩增的成功案例，但使用的主要是基于PCR的全基因组扩增技术，如简并寡核苷酸引物扩增技术（DOP-PCR）（Telenius et al.，1992）和接头介导的PCR扩增技术（LA-PCR）（Chen & Armstrong，1995）。这些技术存在非特异性扩增、扩增偏倚和扩增结果基因组覆盖度低等问题。如果能使用单细胞测序技术进行植物单条染色体的扩增，则可以从根本上解决这些问题，具有可预期的广阔应用前景。但是，目前关于这方面研究的报道较少。殷卉等（2015）在巴西橡胶树上尝试应用单细胞测序技术对橡胶树单条染色体进行体外扩增，但一直未见后续的研究报道。

植物单条染色体的体外扩增除了对极微量模板的考验以外，外源污染的防控还是该技术应用的重要环节，如何有效防控外源污染是微量模板能否正确扩增和保证后续测序质量的关键因素。但是，基于MDA、MALBAC技术的扩增敏感性，即使有极微量外源核苷酸模板的存在也可能造成污染的扩增和放大，从而造成假阳性现象并导致扩增失败。扩增过程中外源污染可能来源于实验环境，也可能来自实验试剂、水、各种缓冲液，扩增使用的枪头、离心管等耗材器具以及染色体制备和分离过程中使用的玻片、玻璃针等（王发明等，2010）。此外，实验室环境下的气溶胶污染也不容忽视（杜茜等，2015）。因此，只有在植物单染色体体外扩增的各个环节都应该对外源污染进行严格防控，才能保证扩增的高质量。

目前，单染色体测序还未见有成功的报道，笔者在同测序公司和其他单位相关领域人员交流时，发现普遍存在假阳性现象严重而目标染色体却没有得到有效扩增的问题。针对这种问题，尚未见有人进行过系统研究和提出可行性建议，特别是对假阳性现象形成的原因和污染的主要来源还认识不足，这样不利于有针对性地提出外源污染防控策略和改进实验方案。

本研究尝试使用单细胞测序的方式对小麦单条染色体分离后进行体外扩增和测序，在严格防控外源污染的前提下，针对实验过程中普遍遇到的假阳性问题进行研究，旨在探讨其可能来源和形成原因，并针对单染色体测序存在的主要问题提出可行性建议，以期为植物单染色体测序的开展提供经验和参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

六倍体中国春小麦（2n=6×=42）种子，由中国科学院遗传与发育生物学研究所王道文课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 小麦中期染色体制备和单条染色体分离 将六倍体中国春小麦种子用冷水于4 ℃冰箱浸泡1 d后，置于25 ℃下避光培养，当其根尖长至1.5～2.0 cm时，用锋利的刀片将其切下，用0.1%秋水仙素预处理3 h，无菌水洗净后用卡诺固定液（冰醋酸∶纯酒精=1∶3）于低温下固定5 min，转入70%酒精中，4 ℃冰箱保存。使用时用镊子取出所需数量的根尖，用无菌水冲洗3遍，控干水分。分别加入體积比4%和3%的纤维素和果胶酶20 μL，37 ℃ 酶解45 min，酶解完成后，用无菌水冲洗3遍，控干水分，滴加10 μL卡宝品红染液，用枪头将根尖捣碎，略放置后进行压片。先将压片完成后的玻片置于-70 ℃超低温冰箱中放置30 min，再迅速揭掉盖玻片，置于倒置显微镜下观察和使用微细玻璃针法进行显微分离（Nikon Ti-S研究级倒置显微操作系统）。在分离单条染色体的同时，也分离包含全部中期染色体的单个完整细胞作为对照。

1.2.2 染色体MALBAC扩增 分离后的包含全部染色体的单个完整细胞和单条小麦染色体是使用亿康公司的MALBAC微量基因组快速扩增试剂盒（KT110700324）来进行扩增。操作过程详情见使用说明书（http：//www.yikongenomics.com/upload/2017/1124/KT1107003_MALBACweiliangjiyinzukuaisukuozengshijihechanpinshuomingshu_zhongwenPM-40c9e.pdf）。根据说明书分别将扩增循环数设置为适合单条染色体扩增的21个循环和常规的17个循环。扩增完成后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 染色体MDA扩增 分离后的包含全部染色体的单个完整细胞和单条小麦染色体是使用Qiagen公司的REPLI-g Single Cell Kit（Cat No./ID：150343）来进行扩增，操作过程详情见使用说明书（https：//www.qiagen.com/cn/resources/resourcedetail？id=38faca1c-64b0-4281-aab3-aa8324bbd181&lang=en）。扩增完成后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。在使用试剂盒自行体外扩增的同时，使用安诺优达基因科技有限公司提供的解离液在分离部分单条染色体后委托其进行体外扩增。

1.2.4 污染源排除实验 为了研究染色体扩增过程中的假阳性现象以及对外源污染的可能来源进行排除，我们委托亿康基因公司使用MALBAC技术对实验使用的无菌水、PBS溶液、离心管和试剂盒本身进行了检测。实验设计如表1所示。

1.2.5 SCoT分子标记检测 由于SCoT分子标记是一种目标起始密码子多态性标记，因此可以用来检测外源污染物是来自其他外源物种基因还是因引物多聚体形成的。SCoT引物是根据Collard & Mackill （2009）和Luo et al.（2011）公布的引物序列来合成。本研究用于单染色体扩增产物的PCR检测的SCoT引物如表2所示。

使用20 μL反应体系：2×Taq PCR Mix 10 μL、扩增产物（稀释1 000倍，约30 ng·μL-1） 1.0 μL、10 μmol·L-1引物0.8 μL、超纯水8.2 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环35次;72 ℃延伸10 min。取8 μL扩增产物，使用2%的琼脂糖电泳检测。

1.2.6 Southern杂交鉴定 将小麦全基因组DNA酶切产物与染色体扩增产物及阴性对照一起进行电泳，并通过印记杂交的方式转移至带正电荷的Hybond尼龙膜上，小麦全基因组DNA经酶切、标记后作为探针进行杂交。具体操作步骤参照罗氏公司生产的“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter-KitⅠ（Roche）”试剂盒说明书进行。

1.2.7 高通量测序 选择小麦染色体假阳性扩增产物，构建单细胞基因组MDA类型文库，文库质检合格后，使用Illumina测序平台进行高通量测序，测序读长PE150。对过滤后的高质量数据随机抽取10 000条Reads数据，通过Blast软件比对NT库，分析可能的污染源。

2 结果与分析

2.1 小麦中期染色体制备和显微分离

在40倍镜下，寻找到分散良好、视野清晰的小麦中期染色体分裂相，制备微细玻璃针，使用显微操作仪准确挑出单条小麦染色体（图1）。染色体通过静电作用吸附在针尖上，迅速转移至放有裂解液的200 μL离心管中，8 000 r·min-1简短离心20 s，进行后续扩增实验。

2.2 MALBAC和MDA方法对小麦染色体进行扩增出现假阳性现象

分别使用基于MALBAC技术的MALBAC微量基因组快速扩增试剂盒（KT110700324）和基于MDA技术的REPLI-g Single Cell Kit（Cat No./ID：150343）进行扩增的结果显示（图2），包含全部染色体的完整细胞的扩增条带（1号泳道）跟单个染色体的扩增条带（2号泳道）带型基本一致。但是，两种方法中无菌水阴性对照（3号泳道）和PBS阴性对照（4号泳道）也分别扩增出了与目标样品明显类似的条带。两种使用单细胞测序试剂盒进行扩增的方法均出现假阳性现象，说明扩增过程中可能存在外源DNA污染。

2.3 可能污染源的排除

为了排除假阳性现象出现的可能原因，我们委托亿康基因公司使用MALBAC单细胞扩增试剂盒，针对扩增过程中使用的无菌水、PBS溶液、离心管以及试剂盒本身分别进行了排除。研究结果表明，体外扩增使用的水及各种试剂、耗材均未检测到明显扩增，没有扩增条带出现（图3：A），而阳性对照却扩增出了明显条带（图3：B），说明污染在可控范围之内。经咨询公司得知，其检测时在第二轮扩增使用的是17个循环，不是本实验进行单染色体扩增使用的21个循环。当我们改为17个循环进行扩增时，染色体及阴性对照均没有扩增出条带。这说明在较高的循环数下，BALBAC单细胞技术容易产生非特异性假阳性扩增。

2.4 使用SCoT分子标记对扩增结果进行初步验证

既然试剂耗材没有产生明显的外源污染，那么为什么使用MALBAC技术扩增时增加循环数或者使用MDA技术扩增时却均出现了较明显的假A. 使用MALBAC技术对分离的染色体进行扩增（循环数21）; B. 使用MDA技术对分离的染色体进行扩增。1. 一个完整细胞的全部染色体; 2. 单条染色体; 3. 无菌水阴性对照; 4. PBS阴性对照; M. DNA Marker-Q，分子量大小分别为200、400、600、800、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、4 000、5 000、6 000、8 000、10 000 （bp）。

A. Amplification with MALBAC technique （21 cycles）; B. Amplification with MDA technique. 1. Whole chromosomes of a single wheat cell; 2. A single chromosome of wheat; 3. Negative control （sterile water）; 4. Negative control （PBS solution）; M. DNA Marker-Q，molecule weight are 200，400，600，800，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，4 000，5 000，6 000，8 000，10 000 （bp），respectively.

陽性现象呢？其可能形成的原因是什么？为此，我们使用SCoT分子标记来检测外源污染是来自其他外源物种基因还是由于引物多聚体形成。扩增结果显示（图4），阴性对照和MALBAC技术扩增的样品均没有明显的多态性条带出现，而使用MDA技术扩增的样品使用引物P17和引物P21时，包含全部染色体的单个细胞（3号）和单条染色体（5号）却有两个样品出现了较明显的扩增条带，说明这两个样品可能是真实外源基因的扩增。

2.5 使用Southern印迹对扩增结果进行验证

为了进一步验证上述3号和5号样品是否为小麦染色体的真实扩增还是外源物种基因的扩增，我们对其进行了Southern杂交验证，使用小麦基因组DNA标记的探针对这两个样品的MDA扩增产物进行杂交，结果显示除基因组阳性对照外，这两个样品及阴性对照均没有杂交信号出现（图5）。因此，证明该扩增产物可能是外源物种DNA污染造成。

2.6 高通量测序和序列比对验证污染类型及可能来源

为了进一步证明该污染源的可能来源及其类型，我们对3号和5号样品的扩增产物进行了全基因组测序，并随机挑选委托安诺优达基因科技有限公司扩增的2个样品（MDA01和MDA02）进行建库测序。将以上4个样品的测序结果进行比对后显示，其均未比对到小麦基因组上，而比对到了人（Homo sapiens）、微生物（Propionibacterium acnes、Cutibacterium acnes）、黑猩猩（Pan troglodytes）等物种上（表3）。其中，Cutibacterium acnes （Propionibacterium acnes）和Propionibacterium phage两种微生物均可以栖息在人的皮肤上（Lood & Collin，2011; Brigitte et al.，2018）。

3 讨论

首先分离单条染色体，然后再进行体外扩增，A 1-6. 实验1 中的PBS、水、空白各2次; 7-8. 实验3中的水各2次; 9-14. 实验2 中的PBS、水、空白各2次; 15-18. 实验4中的水、空白各2次。 B 1702A试剂17个循环扩增效果。1. 阳性样本（50 pg小麦基因组DNA）; 2-3. 空白对照。

A 1-6. Detection of the PBS，water，blank in Test 1，each repeated twice; 7-8. Detection of the water in Test 3，repeated twice; 9-14. Detection of the PBS，water，and blank in Test 2，each repeated twice; 15-18. Detection of the water and blank in Test 4，each repeated twice. B Detected by MALBAC technique with 17 cycles. 1. Positive sample （50 pg wheat genomic DNA）; 2-3. The blank control.

1-2. 空白对照扩增产物（MDA扩增产生的假阳性产物）; 3. 使用MDA技术扩增的一个细胞的全部染色体（42条）;  4-5. 使用MDA技术扩增的单条小麦染色体; 6-7. 使用MALBAC技术扩增的单条小麦染色体。

1-2. Amplification products of blank control （false positive amplification products with MDA）; 3. Amplification products of the whole 42 chromosomes in a cell of wheat with MDA technique; 4-5. Amplification products of a single chromosome of wheat with MDA technique;  6-7. Amplification products of a single chromosome of wheat with MALBAC technique.

建立单条染色体DNA文库，对于构建高密度分子标记连锁图谱和分离重要基因、基因物理作图和染色体进化等研究具有重要应用价值。在高通量全基因组测序中，一些物种基因组比较复杂，由于多倍体、杂合程度高或重复序列多等问题而导致后续数列的组装和拼接困难，且质量和效率低。如果能分离出单条染色体，针对单条染色体进行扩增和测序，则会大大降低物理图谱构建的难度。

近些年来，虽然国内外多家单位尝试使用单细胞测序的技术进行单染色体测序研究，但目前还没有成功的报道，主要原因是外源污染的假阳性扩增严重。本研究在严格防控外源污染的基础上，针对单染色体测序过程中出现的假阳性问题进行研究，探讨其可能的污染途径和来源，并提出个人观点：（一）假阳性现象难以完全避免。首先，单染色体的分离和体外扩增涉及较多步骤，每个步P. 阳性对照（小麦基因组酶切产物）; 3. 图4中3號（一个完整小麦细胞的全部42条染色体）扩增产物; 5. 图4中5号（单条小麦染色体）扩增产物; N. 假阳性扩增产物。

P. Positive control （restricted wheat genomic DNA）; 3. The same amplification products as the above sample No. 3 in Fig. 4 （the whole 42 chromosomes in a wheat cell）; 5. The same amplification products as the above sample No. 5 in Fig. 4 （a single wheat chromosome）; N. False positive amplification products.

骤涉及使用较多试剂、耗材和不同操作空间，绝对控制外源污染困难较大。其次，在使用MALBAC技术进行扩增时，在第二轮使用较多的循环数会增加假阳性现象发生的几率;而使用MDA技术进行扩增时，阴性对照也往往产生假阳性现象（ Marcy et al.，2007; Yilmaz et al.，2010）。两种单细胞测序技术对模板的扩增均具有较高灵敏度，假阳性的存在可能是因为极微量外源DNA在目标样品缺乏时被扩增或引物自身形成的引物多聚体现象，如果在目标样品存在并获得优先扩增的情况下，外源污染的扩增或多聚物的形成则会被抑制。本研究在对假阳性产物进行测序分析时发现，污染物的来源与人体密切相关，其他来源的污染相对较少，说明对环境、试剂、耗材等的污染较易防控。但是，人体无法使用常规方式对外源DNA进行降解和破坏。因此，在实验过程中，要严格避免人体任何部位与实验试剂、耗材甚至操作环境的直接接触，要全程穿戴一次性鞋套、口罩、帽子、实验服等，最大限度的减少外源污染。（二）单染色体扩增失败可能并不是因为模板量太小，而是由于染色体本身没有得到有效扩增。本研究中，使用一个完整细胞的全部42条染色体进行扩增，同样没有获得目标样本的基因组扩增信息，而小麦基因组大小为15.4～15.8 Gb（Appels et al.，2018），却大于已经成功进行单细胞测序的绝大多数物种。因此，推测本实验使用单细胞技术进行小麦单染色体扩增失败的主要原因可能在于染色体的形态。染色体的高度浓缩超螺旋状态会影响组蛋白的去除及DNA变性，一般的裂解条件可能无法使DNA从这种超螺旋状态转变为线性且可以与引物有效结合的状态，无法有效启动复制。此外，染色体制备过程中残留的固定剂、染色剂等成分可能会对组蛋白消化和DNA聚合酶反应等造成影响。

为成功使用单细胞测序技术进行单条染色体的体外扩增，建议从以下几个方面进行尝试：（1）整个操作过程必须保证完全的无菌环境，所使用的仪器、器皿等工具应严格高压灭菌和紫外线灭菌;体外扩增试剂应选用经过严格无菌化处理的商品化试剂盒;实验用水和其他试剂必须进行严格的灭菌和质量检测，确保无外源DNA污染后方可使用;严格做好自身防护，减少人体裸露部位暴露在环境中的机会;全程设无菌水阴性对照;最好使用新建实验室和新的超净工作台等进行操作，且需将染色体分离和扩增两个环节在不同实验室分开进行，避免气溶胶的污染。（2）通过高盐缓冲液、使用蛋白酶K消化、延长消化时间等措施尽量去除组蛋白，同时综合运用生物酶（如拓扑异构酶等）、离心机械力等方法，尽可能地使染色体变为松散的线性状态。（3）评估染色体制备过程中不同药剂对后续实验的影响，选择最合适的染色体制备和染色方法，并争取在前处理过程中通过减少操作时间、中和反应和溶剂冲洗等措施降低或去除这种影响。建议使用较温和的方法获得染色体悬浮液后不经染色直接使用微细玻璃针（管）吸取分离，进行后续裂解和扩增反应。本研究团队在总结和深入解析单染色体测序失败原因的基础上，通过改进染色体悬浮液制备和分离方法，增加蛋白酶K消化等步骤，目前已成功分離和体外扩增了小麦的单条植物染色体，并经过了Southern杂交验证，但显示杂交信号不是很强，目前正在进行质量评估，相关研究结果将在后续文章中进行报道。

本研究针对使用单细胞测序技术进行单染色体体外扩增和测序过程中普遍遇到的扩增失败和假阳性问题，进行了具体地分析和探讨，并提出了可行性建议，为进一步改进植物单染色体扩增技术提供借鉴。

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（责任编辑 蒋巧媛）