富血小板血浆在生育力保护方面的应用进展

李晓凤，王芳，杨凤娜，陶丽梅，杨欣

不孕症是指育龄期男女不避孕、有规律性生活12个月但未获得临床妊娠，不孕症的发生率因不同国家、地区和民族而有所不同，其中患病率最高的地区是南亚、撒哈拉以南非洲、北非、中东、中欧、南欧和中亚[1]。2013年统计美国不孕症的发病率约为15.5%[2]。现代社会男女学习工作压力大，生活环境复杂，生育年龄普遍推迟，且部分伴有精神过度紧张、肿瘤疾病放化疗史、女性卵巢储备不良、排卵障碍、输卵管不通、子宫内膜容受性差和男性精液异常、勃起功能和射精能力障碍等，这些原因均可能引起男女不孕不育。再者性生活是生育必不可少的环节，满意的性体验和性生活频率也是生育力保护的范畴。

富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）被报道应用在多个学科促进组织再生，如口腔科[3]、颌面外科[4]、骨科[5]、运动医学[6]、眼科[7]和周围神经修复[8]等。本研究主要关注其在生育力保护方面的应用进展，PRP可用自体血制备、易获得、成本低、含有高浓度生长因子、无毒和无过敏性，有望成为生育力保护的新方法。迄今为止，很少有PRP的不良影响的报道[9]。然而，PRP的临床疗效存在争议[10-11]。可能的原因是临床实践中制备PRP方案的可变性[12]。这种差异可能引起对其临床疗效的争议，并阻碍其进一步应用[13-14]。本研究旨在探讨影响PRP质量的因素，以期规范PRP制备过程，获得最佳治疗效果。

1 PRP改善生育力的应用

1.1 PRP宫腔灌注可提高子宫内膜容受性 Chang等[15]于2015年首次将PRP用于5例标准激素替代治疗（HRT）后仍因子宫内膜薄（＜7 mm）而取消移植的体外受精（IVF）妇女，5例均临床妊娠，只有1例因染色体异常流产。越来越多文献报道PRP宫腔灌注应用于胚胎移植（ET）前难治薄型子宫内膜患者，可以提高子宫内膜厚度、降低周期取消率并提高临床妊娠率[16-20]。PRP宫腔灌注也逐渐用于治疗辅助生殖反复着床失败（recurrent implantation failure，RIF）患者，Coksuer等[21]观察34例子宫内膜不良并接受PRP+冻胚移植（FET）的RIF患者和36例具有最佳子宫内膜且仅接受FET的RIF患者的妊娠结局，PRP组在PRP干预前子宫内膜厚度＜7 mm，对照组子宫内膜厚度满意，最终PRP组干预后与对照组在FET前子宫内膜厚度比较差异无统计学意义（P=0.90），临床妊娠率（35.2%vs.22.2%，P=0.042）和出生率（41.2%vs.16.7%，P=0.045）均显示PRP组高于对照组。自然流产率和异位妊娠率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究提示了PRP促进薄子宫内膜RIF患者的子宫内膜增厚，并改善薄型子宫内膜RIF患者冻胚移植结局。PRP宫腔灌注也可改善子宫内膜厚度满意的RIF患者的妊娠结局，有学者将PRP宫腔灌注应用于子宫内膜厚度满意的RIF患者，且通过自身前后对照研究及单中心前瞻性随机对照研究证实可提高子宫内膜厚度满意的RIF患者的临床妊娠率[22-23]。

1.2 PRP改善卵巢储备功能 Farimani等[24]将PRP应用于19例拟行黄体期促排卵方案的卵巢反应不良患者，第1次取卵后立即向每个卵巢注射2 mL PRP，第2天再行促排卵。6例患者在PRP干预前后记录卵泡刺激素（FSH），其中5例患者FSH降低。12例患者完整参加了2次取卵，前后平均取卵数（0.64 vs.2.10）。11例患者第1次未取到卵。2例患者接受PRP卵巢刺激后自然妊娠并足月分娩。另1例患者曾有10次卵胞浆内单精子注射（ICSI）+IVF-ET失败病史，且PRP卵巢干预前的2个周期均未取到卵，该患者接受PRP卵巢刺激后，获2枚囊胚，移植后剖宫产一足月男婴。Sfakianoudis等[25]将PRP卵巢注射应用于1例经历12次卵巢微刺激周期和3个自然周期共4次ET失败的患者，该患者FSH为18.3 mIU/mL，AMH 为 0.54 ng/mL，PRP经阴道超声多点注入卵巢髓质并在皮质下扩散，每个卵巢5 mL，1个月经周期后FSH为4.1 mIU/mL，AMH为0.93 ng/mL，最后自然妊娠，随访至孕24周且未发现并发症。该研究报道另外2例获卵率低、卵子质量差且受精率低的患者经PRP卵巢刺激后AMH、FSH改善，均临床妊娠。Sfakianoudis等[26]在阴道超声引导下将PRP应用于1例绝经5年的40岁不孕症女性患者（FSH=149 mIU/mL，AMH=0.02 ng/mL），每个卵巢取3个部位注射PRP共4 mL，PRP治疗6周后，月经恢复（FSH=27 mIU/mL，AMH=0.08 ng/mL），PRP 治疗8周后患者在月经第16天取到1枚卵，卵泡直径18 mm（LH=17 mIU/mL，E2=270 pg/mL，孕酮 1.4 ng/mL），行ICSI得到1枚2个原核的6-细胞三级卵裂期胚胎，移植后血hCG最高达800 mIU/mL，但在妊娠第5周发生自然流产。该病例也支持PRP卵巢内注射可提高早绝经不孕患者的生育力。

1.3 PRP应用于化疗后和局部创伤后生育力保护 有动物研究静脉注射PRP干预环磷酰胺诱导的卵巢早衰雌鼠模型，发现PRP对于卵巢皮质体积、窦前卵泡数、窦前卵泡直径具有积极改善作用，但静脉注射PRP对正常大鼠卵巢的不同结构和功能无影响[27]。Dehghani等[28]继续研究发现对于化疗药白消安诱导的无精子症动物模型，PRP显著增加大鼠精原干细胞数、精子计数、精子活力、精子尾长和睾酮水平，但对睾丸体积、支持细胞和间质细胞数和生精小管长度无影响，PRP明显改善睾丸结构和功能损伤。由此可见，PRP对于化疗损伤后患者的生育力保护具有积极作用。动物研究提示PRP腹腔注射对于卵巢扭转引起的缺血再灌注损伤具有改善作用，卵巢的总氧化状态（TOS）、氧化应激指数（OSI）和卵巢组织病理学评分均得到改善[29]。

1.4 PRP改善生殖内分泌和性行为反应 有学者报道勃起功能障碍患者阴茎海绵体注射富含高浓度生长因子的PRP有利于勃起功能的恢复[30]。有研究也支持PRP促进男性勃起功能障碍患者性功能恢复[31-32]。卵巢储备功能不足患者卵巢内注射激活的PRP可改善患者体能、睡眠质量、肤色、头发数量、认知清晰度、月经周期、宫颈黏液、阴道润滑度、性欲、达到性高潮的能力和性体验，提示直接向卵巢组织注射PRP可能提供的局部微环境利于卵巢组织分泌激素，并改善卵巢低储备患者的妊娠结局[33]。

2 理论依据

PRP中血小板浓度是全血的4～6倍，且富含大量促进组织修复、细胞外基质合成、血管生成及抗菌细胞因子[34-35]。激活的PRP形成富血小板血浆凝胶，具有的三维网状支架可以作用于靶细胞，调控靶细胞的部分基因表达，促进功能蛋白质合成。激活的PRP浓缩血小板通过脱颗粒途径，α颗粒分泌释放多种生长因子，局部高浓度生长因子可增强组织修复过程，如血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor，IGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子 β（transforming growth factor，TGF-β）和成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）等[36-37]。多种细胞因子协同作用，比局部运用单个细胞因子效果更显著[38]。这些生长因子在细胞迁移、增殖，血管生成及伤口愈合的各个阶段都具有重要的调节作用。在最终的PRP制剂中可能存在大量白细胞，富含白细胞的 PRP（L-PRP），可以增强 PRP 作用[39]。且 PRP 富含大量抗菌蛋白，如：抗菌结缔组织激活肽3、血小板因子4、调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子（RANTES）、胸腺素β-4、血小板碱性蛋白、纤维蛋白肽A和纤维蛋白肽B[40]，抗菌分子作用于细菌细胞膜阻碍蛋白质合成[41]。除细胞膜外，也可以靶向作用于细胞内蛋白质干扰DNA合成或抑制酶活性[42-43]。体外研究提示，尤其在酸性微环境，相比抗真菌活性，这些分子具有更强的抗细菌活性[41]。

3 PRP的制备及影响其质量的因素

3.1 PRP的制备 目前制备RPP主要采用两次离心自体或异体静脉血，离心前添加合适抗凝剂可避免血小板被提前激活造成血小板颗粒释放大量生长因子和细胞因子，影响最后制得的PRP质量。离心后添加激活剂制备的PRP凝胶也关系PRP的生物活性，激活剂的种类、浓度与PRP中生长因子的释放量及持续作用时间相关，且PRP凝胶具备的三维网状支架有利于组织破损处快速粘合，减少血小板的流失，保证血小板能够在局部长时间分泌生长因子，从而使生长因子能够长时间局部保持较高浓度。将加入抗凝剂的全血第1次离心（300 r/min×10 min）可得上中下三层，下层是红细胞层，中层是PRP层，上层是贫血小板血浆层，弃去下层红细胞层，将剩余部分再次离心后（500 r/min×10 min），弃去上清液，剩余部分为PRR，选择合适的激活剂加入PRP使得形成PRP凝胶[19]。国外部分实验采用1 500 r/min×10 min+3 000 r/min×10 min[44]，也有研究采用 2 300 r/min×1.5 min+2 300 r/min×5 min[45]。目前报道制备PRP的离心方式较多，尚无统一标准。常用的抗凝剂有：肝素、柠檬酸钠和乙二胺四乙酸钠（EDTA）等，常用的激活剂有：Ⅰ型胶原、牛凝血酶和氯化钙等。不同的转速、离心力、离心时间、抗凝剂和激活剂对于制备的PRP的成分影响很大。截至2002年有40多种血小板生物制品[46]。对此研究颇多，但是还有其他影响PRP质量的因素未引起重视。

3.2 志愿者的临床、社会特征及服药史对PRP质量的影响 对36例健康日本志愿者全血制备的PRP分析发现，年龄与PRP中的血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）浓度呈负相关（r分别为-0.32和-0.39），性别对生长因子无影响。PRP中血小板计数与 PDGF-BB、TGF-β1、EGF 和肝细胞生长因子（HGF）呈正相关（r分别为 0.39、0.75、0.71 和 0.48）[47]。烧伤患者与健康志愿者分别采全血制备PRP，血小板浓度无差异，生长因子 TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF、EGF 和FGF-2 均无差异，但在健康志愿者组发现血小板浓度与生长因子浓度 TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF存在相关性[48]。可见，PRP的生理活性差异受志愿者年龄和血小板计数的影响，且烧伤患者必要时也可以作为PRP制备的志愿者。20例健康受试者（年龄21～45岁）参加了20 min的剧烈运动训练，运动前后分别采血制备PRP，运动后全血血小板浓度增加20%，PRP容积增加，动员造血干细胞增殖的能力更强，且PRP中白细胞成分更多[49]。一项关于萘普生对富白细胞血小板血浆（L-PRP）中生物因子影响的前瞻性研究提示：服用萘普生1周后制备的L-PRP中的生长因子明显减量，经历1周的洗脱期后再制备L-PRP可使PDGF-AA、PDGF-AB和白细胞介素6（IL-6）恢复基线水平，并发现制备的L-PRP的活性因子差异与性别无关。且年龄与L-PRP包含的合成代谢因子FGF-2、分解代谢因子TNF-α、IL-1b 呈负相关。体质量指数 （BMI）与VEGF-A、FGF-2和IL-6之间呈负相关。因此，在制备L-PRP前不使用非甾体类抗炎药，谨防减弱L-PRP的治疗作用，而萘普生经历1周的洗脱期后制备的L-PRP可恢复基线状态，可能与萘普生可逆性抑制环氧化酶活性影响血小板功能有关。但是该研究只研究了一种非甾体抗炎药，其他同类药是否也会影响L-PRP中细胞因子表达可进一步研究确定[50]。有研究报道不同红细胞压积的全血影响所制备的PRP中所含白细胞的浓度，特殊处理后相比1%、0%的红细胞压积，2%红细胞压积的全血制备的PRP富含更多白细胞，其主要成分是淋巴细胞，PDGF和重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）显著升高，IGF-1显著降低，VEGF无明显变化[51]。

3.3 抗凝剂和激活剂的选择对PRP质量的影响 动物研究提示，相比肝素、柠檬酸钠组，以乙二胺四乙酸钠（EDTA）为抗凝剂制备的PRP的血小板回收率最高，为（69.81±10.9）%，且血小板活性成分CD62p和PAC-1的表达明显增高；对于激活剂的选择，添加激活剂Ⅰ型胶原后D3、D5两个时间点，PDGF的累积释放量均显著高于其他各组（P＜0.05），而凝血酶作为激活剂，2 h时释放PDGF最多，且与第5天PDGF累积浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。TGF-β的累计浓度与时间的关系和PDGF很相似，且添加Ⅰ型胶原作为激活剂后，从第1天开始Ⅰ型胶原激活的PRP TGF-β的累积释放量显著高于其他各组（P＜0.05）[52]。有研究进一步报道；相比较EDTA-凝血酶组、肝素-凝血酶组、肝素-Ⅰ型胶原组，EDTA作为抗凝剂联合Ⅰ型胶原作为激活剂制备的PRP凝胶所释放生长因子的浓度最大[53]。氯化钙和凝血酶作为激活剂的比较研究中，也不支持将凝血酶作为激活剂[54]。分析原因可能是氯化钙激活PRP产生的纤维蛋白较厚且交联好，而凝血酶产生的纤维蛋白很薄，并且经常融合在一起，相对容易被降解，氯化钙较凝血酶作为激活剂更利于减少生长因子在扩散过程中的损失，但是关于Ⅰ型胶原和氯化钙分别作为激活剂进行比较的研究未有报道。目前关于PRP制备过程中不同抗凝剂和不同激活剂联合应用的研究较少。有文献报道使用不同脉冲电场（PEF）激活PRP对生长因子释放和血小板形态也可产生不同影响[55]。

3.4 PRP保存条件对PRP质量的影响 PRP是否可以长时间保存存在争议，有文献报道应用新鲜制备的人PRP效果更佳，如果必须长时间保存，激活后-70℃条件储存有利于生长因子浓度和生物活性的保持[56]。制备的PRP最好6 h内用完[57]。但也有文献支持PRP可以长期保存，将海藻糖作为保护剂应用于冻干PRP（FD-PRP）并室温保存12周后电镜观察血小板结构完整清晰，流式细胞术检测血小板活性成分PAC-1和CD62P无差异，酶联免疫吸附实验检测生长因子TGF-β、PDGF与VEGF均无差异，FD-PRP促进细胞增殖方式同新鲜PRP。分析两个实验结果的差异性提示：激活后再保存的PRP活性受保存时间和保存温度的影响，超低温冷冻干燥后且未被激活的PRP更利于长时间室温保存。da Silva等[58]也支持FD-PRP技术可延长PRP的储存期。该研究证实壳聚糖（Chitosan，CS）作为保护剂作用与海藻糖相同，可用于FD-PRP的保存，体外研究证实CS-PRP比PRP累计释放更多生长因子，且活体动物研究提示CS-PRP植入物在皮下放置至少6周后被完全吸收，并能诱导细胞募集和肉芽组织合成，并认为其在体内比PRP具有更长的驻留时间和更高的生物活性[57-58]。

4 PRP使用的风险及安全性

PRP使用的安全性一直受到关注。16篇PRP治疗糖尿病足溃疡患者的随机对照研究的Meta分析中只有4篇研究报道了不良反应，其中1项研究应用PRP后出现感染，但试验前后培养结果相同，感染可能与PRP治疗无相关性；另一项研究报道PRP治疗组患者出现1例截肢，对照组也同样出现截肢病例，提示截肢与患者病情有关，与治疗方式选择相关性小；1篇研究报道PRP治疗后伤口再次裂开，分析可能与患者病情有关[59]。1例胫骨远端单纯骨囊肿患者选择骨囊肿注射3 mL PRP，24 h后患者上肢皮肤出现红色丘疹，检测患者柠檬酸钙（PRP制备时所用的一种抗凝剂）皮内点刺试验阴性，皮内注射阳性。抗组胺治疗后出院，6年随访中再无过敏性疾病的症状。这说明PRP使用不是绝对安全的。PRP制备过程可能降低这种安全性，建议应用前进行过敏原检测试验[60]。但PRP的制备除了自体血液，也可以选择同种异体志愿者，因此传染病检测也不容忽视。

5 结语

综上所述，PRP可改善子宫内膜容受性、卵巢储备功能、化疗后及缺血损伤后生殖器官结构和功能的恢复、男女生殖代谢和性行为反应，给不孕不育患者带来希望。PRP发挥作用所依赖的生长因子水平、血小板浓度及PRP凝胶的结构受较多因素影响，如：离心转速、离心时间、抗凝剂、激活剂、保存时间、冷冻温度、保存剂、志愿者（年龄、BMI、血小板浓度、红细胞压积、运动史、非甾体类抗炎药服用史）等。但目前PRP应用于生育力保护的研究仍较少，探索PRP制备过程的相关影响因素的研究也较少，希望以后开展更多关于PRP应用于生育力保护的大样本随机对照试验及基础研究。此外，PRP使用的安全性受制作过程的影响，建议治疗前进行传染病、过敏源等安全性检测。希望通过不断规范PRP的制备过程，使PRP效果最大化，拓展PRP的临床适应证。