代谢组学在支气管哮喘中的应用

王雪婷 顾问

1上海交通大学医学院200025;2上海交通大学医学院附属新华医院呼吸内科200092

支气管哮喘 (哮喘)是一种全球常见的慢性呼吸系统疾病,全球范围内约3亿人口受其影响[1]。2018年全球哮喘防治创议 (Global Initiative for Asthma,GINA)将哮喘定义为一种异质性疾病,通常以慢性气道炎症为特征。其主要表现为既往呼吸症状既往史,如时间和程度多变的气喘,呼吸急促,胸闷,咳嗽,并伴有可逆呼气气流限制。对直接或间接刺激物的气道高反应性以及慢性气道炎症与哮喘有关。然而近年来有文献表明哮喘的临床表现与病理生理学特征与治疗反应之间并无强关联[2]。因此,对哮喘分子层面的理解为精确的预防策略、治疗靶点和开发个性化疗法提供思路。自过去20年来,生物技术进入后基因组学时代,以 “组学”技术为代表的先进研究方法在医学科研中逐渐成为重要手段[3]。其中代谢组学作为一种大规模研究,旨在广泛分析生物标本中的低相对分子质量代谢物(通常＜1 500)[4-6]。由于能够反应体内的瞬时的代谢情况和生理状态,代谢组学能够更敏感地捕捉哮喘患者体内的代谢波动和病理变化,在哮喘这种异质性极高,并随时间变化的疾病的相关研究方面具有其独特的优势。本文综述了2013年以来,重点综述了2016年之后基于代谢组学在哮喘方面的研究进展,其中包括对哮喘诊断、分型、评估和治疗应用。

1 代谢组学技术的发展现况

代谢组学的研究方法分为非靶向性代谢组学以及靶向性代谢组学。非靶向性代谢组学旨在测量所提取样本中所存在的最广泛的代谢物范围,而不需要对其中代谢组有先验了解。所获得的代谢物受到提取和分析方法的影响,但其能够得出较为复杂庞大的数据集,通过计算工具识别和关联所得代谢物,并检查他们在多种代谢通路之中的互联性。相较之下,靶向性代谢组学则较非靶向代谢组学具有更高的敏感性和选择性。靶向性代谢组学通过测量样本中一组预先确定的代谢物的浓度,在具有先验信息的基础上,更优化地针对分析样本中特定的代谢物和代谢途径进行分析。靶向性代谢组学能够得到非靶向性代谢组学所识别出的代谢物更精确的浓度,将两者结合,能够为分析验证提供更好的数据[6]。

在明确实验目的之后,代谢组学的工作流程包括采样及样品前处理,测量代谢物,数据处理和统计分析,其目标是发现具有生物学意义的峰[7-8]。之后研究人员在数据库中对峰进行搜索以获得代谢物的相关信息。

代谢组学的采样范围十分广泛,包括尿液、血清、血浆、唾液、诱导痰、胆汁、脑脊液等生物体液,动物或人体组织 (肝脏、脑、脂肪组织)和细胞[4,9]。在样品前处理阶段,非靶向性代谢组学更注重不破坏代谢成分,获得尽可能全的代谢信息,而靶向性代谢组学更关注提取的效率。目前国内外各实验室对样品制备和特定类别代谢物分析的方案已有广泛讨论[4,7-8,10]。代谢组学测量代谢物的方法主要分为质谱法和核磁共振光谱法。有关其具体原理在他处亦有详细解释[10-13]。由于代谢组学的分析中,尤其是非靶向性代谢组学的数据分析产生复杂的数据集,故而代谢组学的数据处理和统计分析尤为重要。代谢组学常用的数据处理和分析软件包括SPSS、SIMCA-P+、Chenomx NMR套装软件包,其中部分软件自带数据库可以进行分析和比对,其他代谢组学常用的数据库包括PubChem、BioCyc、HMDB和NIST 等。但由于数据库中的信息有限,许多峰值仍然无法在数据库中匹配到分子结构[14-15]。故而建立完善的代谢组学数据库也是代谢组学及相关生物研究领域发展的重要步骤。

2 代谢组学在哮喘中的研究

至今,通过对于不同样本的代谢组学研究,在哮喘的诊断、鉴别诊断方面有所进展,已有许多研究报道哮喘患者的各类来源样本内的代谢谱与健康对照、COPD 患者、肺囊性纤维化患者有所区别[16-23]。此外,代谢组学研究在哮喘的用药、评估等方面也有报道。

2.1代谢组学在哮喘的诊断和鉴别诊断中的研究进展 哮喘目前的诊断仍主要依靠典型呼吸道症状以及可逆性呼气受限两点[1],实验室检查的可靠性仍缺乏证据支持,目前有多个实验室对于通过对哮喘患者和健康对照不同来源的样本进行代谢组学研究提供了在哮喘诊断方面的线索。非靶向代谢组学方面,Ibrahim 等[18]通过对呼出气冷凝液进行研究发现了5个区别哮喘和健康对照的区域。靶向代谢组学发现磷脂代谢通路可能在哮喘的发病机制及诊断中起到作用。Jung等[19]对哮喘患者和健康对照组的血清进行比较,发现了多种代谢物水平的改变,包括甲基化的增加和脂类代谢改变,其中参与甲基化的磷酸胆碱同样参与体内磷脂合成。Pang等[17]的研究同样发现在哮喘患者,尤其是嗜酸粒细胞性哮喘患者血清中磷脂酰乙醇胺浓度较高。在Ried等[24]的研究中,发现哮喘患者血清中各类磷脂酰胆碱的水平均有波动,并通过基因学方法确定哮喘患者具有和磷脂代谢通路有关的易感基因。这可能与磷脂曾被认为与Th2诱导以及气道高反应性有关[25]。另外,嘌呤通路同样可能在哮喘中起到某些作用。Chang等[21]通过对不同人群血清的研究发现哮喘患者体内的次黄苷显著改变,以及之后Checkley等[22]和Reinke等[26]的研究同样提到了哮喘患者血清中次黄嘌呤的改变都提示了嘌呤通路在哮喘中有所影响。

至今有关哮喘鉴别诊断的代谢组学研究十分有限,目前的研究中还未提示有独特价值的潜在相关通路。Adamko等[20]通过对尿液进行非靶向性核磁共振光谱法研究,在测试过尿液中86种代谢物波动后,研究发现急诊就诊的哮喘患者和COPD 患者的尿液之间有显著差异。另外,van Mastrigt等[23]使用其开发的宽带量子级联激光光谱技术研究哮喘患者、非囊性纤维化患者以及健康对照的呼出气挥发性有机物之间的差异。

2.2代谢组学在哮喘的分型中的研究进展 对疾病进行恰当的分型对哮喘的诊治具有指导意义,不同的哮喘分型可能具有不同的药物选择以及预后,虽然目前对哮喘的亚型分类尚有争议,但通过识别嗜酸性T2 炎症过程有效区分Th2型哮喘和非Th2型哮喘非常重要。因为此前已经有证据表明,针对IgE,IL-4/IL-13 通路,以及IL-5 的吸入性糖皮质激素 (inhaled corticosteroid,ICS)和其他生物疗法的疗效在具有T2 型炎症患者优于没有T2 型炎症的患者[27-29]。经典的用以识别T2 炎症反应的生物标志物包括呼出气一氧化氮 (fractional exhaled nitric oxide,FeNO)、骨膜素、血嗜酸粒细胞计数等。故而通过代谢组学对哮喘进行初步分型,或通过代谢组学研究提供哮喘分型的新思路都不失为一种有价值的想法。Pang等[17]通过对血清进行非靶向代谢组学分析以期得以区分不同哮喘表型的不同代谢特征,及其发病机制,发现在嗜酸粒细胞哮喘、非嗜酸粒细胞哮喘和健康对照之间存在明显区别,其中甘油磷脂代谢、视黄醇代谢和鞘脂代谢被识别为表型间改变最为显著的3种途径。相较非嗜酸粒细胞哮喘,在嗜酸粒细胞哮喘中磷脂酰乙醇胺浓度较高、视黄醇浓度较低。同时,Ejaz等[30]通过蛋白组学研究发现在哮喘患者血清中视黄醇结合蛋白4显著下调。Andino等[31]的研究同样支持视黄醇水平在哮喘患者血清中下调。不同研究发现的共同异常的通路可能提示相应代谢通路在哮喘的发病机制中的作用。

Fe NO 升高可以作为嗜酸粒细胞炎症的指标,Comhair等[32]据FeNO 的分数水平对个体进行分类,对患者血浆293种生化物质进行分析后发现哮喘患者血浆代谢物中25种与健康对照显著不同。相比低FeNO 患者,高FeNO 哮喘患者具有更高水平的血浆支链氨基酸和胆汁酸。这可能能够成为对哮喘进行初步分型的依据。

另外,相对较多的研究表明肥胖人群的哮喘具有其独特的代谢途径,这支持将肥胖型哮喘作为独立分型。已有许多研究证明儿童哮喘与肥胖之间具有正相关关联[33-34]。而且肥胖对肺功能、气流和肺容量,以及气道炎症的出现都有负面作用[35-36]。由于体质量指数对体内的代谢有影响[37-38],故而在肥胖哮喘患者的代谢组学中同样需要考虑肥胖这一因素。Checkley等[22]研究发现肥胖哮喘儿童血清中烟酸含量浓度较高,然而在该研究中没有提示能够区分超重哮喘儿童和非肥胖哮喘儿童的血清代谢物。有关成人肥胖哮喘方面,Maniscalco等[39]的研究提示肥胖患者的呼出气冷凝液具有独特的代谢谱,Liu等[16]通过对诱导痰和外周血的研究发现肥胖哮喘患者相较瘦的哮喘患者的身体组成、哮喘控制程度、IL-1β、IL-4、IL-13、瘦素以及脂肪连接蛋白都极大不同。其中较为突出的通路包括氨基酸代谢,痰中乙醛酸和二羧酸代谢途径等。Loureiro等[40]也曾报道成人肥胖哮喘患者和成人非肥胖哮喘患者具有不同的尿液代谢特征。

2.3代谢组学在哮喘评估中的研究进展 目前哮喘评估分为2个方面：症状控制情况以及不良预后的风险。控制情况主要通过日间和夜间症状以及缓解药物使用的频率来评估,患者控制情况差不仅使患者生活质量下降,同时也增加不良预后的风险[1]。通过靶向性代谢组学研究,有学者发现持续症状控制和不控制的哮喘儿童之间可以通过15种呼出气中的挥发性有机物进行区分,而且其中7种能够预测14 d内该儿童哮喘急性发作[41-42]。目前认为影响不良预后风险的因素主要包括：之前一年中≥1 次病情恶化、较差依从性、血嗜酸粒细胞、肺功能较差、吸入器使用方法错误以及吸烟。Kelly等[43]研究与对不同肺功能有关的代谢物波动,发现了与气道高反应性、支气管扩张剂使用前第1 秒用力呼气容积/用力肺活量 (ratio of forced expiratory volume in first second and forced vital capacity,FEV1/FVC)、使用后FEV1/FVC 有关的不同代谢物,其中磷脂代谢、亚油酸代谢和嘧啶代谢通路是三者共同的相关通路。

通过对哮喘进行严重程度的分级,回顾性地总结对控制症状和恶化所需的治疗。在临床上能够有效提示疾病管理、预后和控制,通过对不同严重程度的哮喘患者血清进行非靶向代谢组学研究提示哮喘以与疾病严重程度有关的适度的全身代谢转变为特征,而其中有一些代谢差异会受糖皮质激素治疗的影响。相对于对照,轻度哮喘的代谢变化与外源代谢物 (例如膳食脂质)相关,而中度和重度哮喘的代谢变化可能与激活瞬时受体电位香草酸1 型受体有关[26]。

2.4代谢组学在哮喘应用药物中的研究进展 此前已提到,有一部分哮喘患者对ICS较不敏感,这可能与其炎症机制有关,非Th2型炎症反应对ICS反应较低。目前,有关哮喘应用药物的研究内容主要包括通过探明与哮喘患者ICS抵抗相关的潜在代谢通路以及对哮喘急性发作患者使用药物后对人体内代谢影响。Park等[45]对吸入性激素抵抗的重症哮喘儿童的尿液进行分析,从其中识别出5个潜在的标记物,酪氨酸代谢和谷胱甘肽代谢被认为是与激素抵抗相关的重要途径。Quan-Jun等[44]测使用布地奈德+沙丁胺醇治疗的急性哮喘发作的儿童血清和尿液中的代谢物波动,识别了包括血清22种和尿液21种波动代谢物,其中精氨酸和脯氨酸、牛磺酸和次牛磺酸、甘氨酸、丝氨酸等7种涉及的代谢通路被识别。

3 挑战与展望

目前有关哮喘的代谢组学研究仍然比较有限。

代谢组学的研究目标和工作流程导致其本身也具有一定的局限性。首先,人体内的代谢产物相较蛋白、基因更容易受到外源的影响而发生改变,Reinke等[26]发现轻度哮喘的脂类代谢可能会受到膳食脂类的影响,这提示研究人员需要加强样本选择和变量控制。另外,不同的试验由于目的和试验设计的不同,对人群的选择和样本的选择都有所不同,可能会导致结论的差异。部分研究中受试仅有20～30人[41-42,45],所得结论是否具有普遍性还有待进一步证明。其次,不同的样本处理方式可能造成未知的代谢物的破坏或影响,从而导致对相同样本的研究结论差异,Cruickshank-Quinn等[46]的研究表明呼出气冷凝液可能受到污染,目前对技术上处理流程的统一也有待发展[47]。另外,由于代谢组学的研究手段繁多,其各自也有其不同的特性。相较之下,非靶向性代谢组学的结果更依赖于受试者选择标准、实验设计和样品制备过程。核磁共振虽然有较高的重复性,所需样品量也较少,然而其敏感性较低。液相质谱或气相质谱虽然更特异和敏感,但是样品处理过程对其结果影响也比较大[4]。最后,由于代谢组学的数据库有待完善[14-15],其中部分研究结果可能无法在其中搜索到对应生物结构。

由于哮喘疾病不仅在个体与个体之间存在差异性,个体本身随着时间、发病控制和用药治疗的情况不同,体内的代谢也会有所差异。未来对于代谢组学的纵向研究仍然有待进行,以进一步观察哮喘患者体内代谢物的波动。这需要依赖于更大型的研究项目,目前已知ASMAL[48-50]和KORA[51]项目曾进行过代谢组学研究[18,24],然而亦未见其进行纵向研究。其他国外的项目还有如AirPROM[52]、EARIP[53]、MeDALL[54]、U-BIOPRED[55],然而他们的组学研究多着重于转录组学和蛋白组学,国内在这方面仍然有待发展。

代谢组学可以用于发展哮喘生物标记物,通过对挥发性有机物和诱导痰等无创样本的研究[23,41-42],在未来可能能够发展出应用于临床的更加快捷简便的方法在哮喘的诊治中发挥作用。同样,代谢组学研究亦可对用药情况进行监测。通过与药物代谢组学的结合应用或许能够提供药物使用后对机体内代谢通路的影响,对哮喘个体化用药治疗进行提示作用。除了单独研究代谢组学,同时结合其他方法,整合其他多学科如转录组学和蛋白组学的研究同样具有意义。

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