基于针铁矿强化乙酸产甲烷过程的ADM1模型修正与模拟研究

刘慧敏, 王 进, 张 勋, 钟 成, 岳正波

合肥工业大学资源与环境工程学院, 安徽 合肥 230009

土壤、沉积物等环境内有机质的厌氧转化在全球碳循环中具有重要作用，挥发性短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸等)的互营氧化是关键环节之一[1-2]. 其中乙酸是产甲烷的主要前体物质，陈斌等[3]从底物CH4表观产率的角度，将玉米秸秆干式厌氧发酵过程中乙酸对产甲烷的作用分为上升、稳定、下降后再稳定和下降4个阶段. 而从反应途径的角度能够对乙酸产甲烷机制进行更深入的研究，目前已知乙酸转化为甲烷可通过两种途径实施：①乙酸裂解型产甲烷途径，乙酸营养型产甲烷菌直接降解乙酸产生CH4和CO2；②SAO(syntrophic acetate oxidation，互营乙酸氧化)产甲烷途径，需要互营乙酸氧化菌和产甲烷菌的互营代谢作用来完成. 互营体系中产甲烷菌具有多种代谢和电子传递通道，乙酸先被互营乙酸氧化菌氧化分解，其过程中产生的电子可以与H+结合生成H2，再以氢型产甲烷途径还原CO2产生CH4，还可以通过具有DIET(direct interspecies electron transfer，直接种间电子传递)功能的产甲烷菌以DIET途径还原CO2进行产CH4[4].

乙酸产甲烷代谢途径的演替受环境因素的影响，近年来国内外研究者发现，以土壤、海洋沉积物、城市污泥厌氧反应器内微生物为接种物，加入磁铁矿、赤铁矿、针铁矿、活性炭、导电碳纤维等能够改变微生物群落组成或产甲烷菌的代谢方式，进而提高有机酸产甲烷过程速率[5-10]. 笔者所在课题组相关研究[11-14]表明，以乙酸钠、水生植物菹草、巢湖蓝藻为底物，接种污泥取自处理啤酒废水的厌氧反应器、乙酸钠定向驯化培养的厌氧反应器，在加入针铁矿、赤铁矿、磁铁矿等导电材料后都可以调控微生物群落，主要表现为促进SAO产甲烷过程. 上述反应体系的共同机制是导电材料的存在为微生物群落创立了高效的种间交互作用，从而促进甲烷生成，可能是体系导电性的提高促进了微生物之间的电子传递效率，也可能是导电材料作为电子载体促进了DIET，有关认识还不够深入，并且目前的试验研究及测定很难区分乙酸裂解、氢型、DIET等途径的贡献.

数学建模是生化过程评估和系统优化的有效工具之一. 传统ADM1模型(厌氧消化1号模型)基于其规律性的总结，能对体系动态变化进行较为准确的模拟和预测[15]. 有学者通过修正ADM1模型成功地描述了SAO过程[16]. 为探究导电材料对产甲烷过程中不同途径的调控作用，该研究考察了不同针铁矿添加量对乙酸钠产甲烷过程的影响，并引入氧化还原介质来描述种间电子的产生与转移，对ADM1模型进行了修正，利用修正的模型对该过程进行了进一步的研究和分析.

1 材料与方法

1.1 试验设计

以300 mL血清瓶为厌氧反应器，有效反应体积为200 mL. 取自合肥市华润型雪花啤酒厂UASB厌氧反应器的污泥，首先过60目(250 μm)筛网去除大颗粒杂质，然后置于25 ℃的培养箱中避光预培养21 d去除其中的硝酸盐、硫酸盐及铁氧化物等电子受体的影响[17]. 避光培养后的污泥浓度〔以VS(volatile solid，挥发性固体)计〕为17.02 gL，用作序批试验的接种污泥. 试验设置两个底物浓度水平，分别标记为a组〔c(乙酸钠)为12 mmolL〕和b组〔c(乙酸钠)为20 mmolL〕，针铁矿加入量为0、40、200、2 000 mgL，共计8组，分别命名为a0、a1、a2、a3、b0、b1、b2和b3，每组设置3个重复. 血清瓶中初始污泥浓度为0.5 gL，以3 gL NaHCO3作为缓冲剂，以1 molL HCl调节初始pH至7.0±0.1，鼓氩气(Ar)5 min排净瓶内空气，用铝塞密封维持厌氧环境，摇匀后置于35 ℃恒温培养箱中培养. 定期取样测定瓶内气体产量、组分及液相成分.

1.2 测试方法

气体产量采用玻璃注射器进行测量，c(CH4)测定采用气相色谱法(SP6890，山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)，不锈钢填充柱5A分子筛，TCD检测器，进样口温度120 ℃，色谱柱温度80 ℃，检测器温度80 ℃，30 mLmin流速的氩气作载气.

采用高通量测序对初始污泥及体系内微生物群落进行分析. 在产甲烷刚结束时从b0和b3体系采集样品，离心后利用土壤DNA抽提试剂盒(E.N.Z.A, OMEGA)提取DNA，送往广州美格生物科技有限公司进行高通量测序. 将测序得到的16S rRNA基因V4高变区序列按照97%的序列相似性进行OTU分类，认为一个OTU可能代表一个物种. 通过比对RDP、Greengene等数据库得到样品中细菌、古菌的相对丰度(属水平). 通过分析微生物群落结构、功能微生物相对丰度的变化推测体系中乙酸降解产甲烷途径.

1.3 模型建立

拓展的模型用AQUASIM 2.1制定和实施[19]，遵循Batstone等[20]的指导原则和建议参数以及Rivera-Salvador等[16]提出的修正.

1.3.1基本假设

根据试验设计，该研究建立的模型不考虑pH抑制、氮缺乏抑制和游离氨抑制. 在ADM1模型中引入氧化还原介质作为新组分，来描述乙酸互营代谢中的电子转移. 定义Mred(还原性介质)和Mox(氧化性介质)为还原和氧化胞外电子的介质，在所建立的模型中被认为是状态变量. 电子转移由Mred和Mox之间的转换(MredMox+e-)来模拟，Mox将接收乙酸氧化产生的电子，并被还原为Mred. 即Mred的增加被Mox的减少所反映，反之亦然，介质的总数量(Ctot)为常数(S_Mred+S_Mox=Ctot).

模型中底物状态变量的输入值为试验设计值. 假设污泥VS为反应器中的微生物浓度，反应器中微生物总量根据试验设计的接种污泥浓度计算，C5H7O2N用于描述生物量[21]，微生物等效摩尔转换系数为8.85 mmolg(以生物量计). 假设模型包含3类微生物(Xac、Xst、Xh2)，各功能微生物浓度的初始输入值由微生物总量乘以相对丰度计算所得. 模型组分如表1所示.

表1 模型中组件的定义

1.3.2模型描述

以ADM1模型为基础，对其结构进行修正. 如表2所示，加入SAO产甲烷过程，即乙酸氧化菌(Xst)与产甲烷菌互营代谢过程，包括乙酸盐氧化过程(过程2)、DIET产甲烷过程(过程3)、产氢气(过程4)和氢型产甲烷过程(过程5). 以Monod方程形式描述乙酸生物氧化过程(过程2)，以一级动力学模拟乙酸氧化菌衰减过程. H2作为乙酸盐氧化过程的最终产物，模型中以一个依赖于液相中H2浓度的抑制因子I_h2来描述其对乙酸盐氧化过程动力学的抑制作用[22].

表2 模型的化学计量矩阵和过程动力学速率方程

注：1)用ρ表示，单位为mmol(L·d)；I_h2=1(1+Sh2KI_h2)

用Mox和Mred描述乙酸氧化过程电子的产生以及互营代谢中电子的传递. 通过把Mox还原成Mred，1 mol乙酸盐被氧化成CO2产生8 mol电子(过程2). 乙酸裂解产甲烷菌通过DIET利用乙酸氧化产生的电子产甲烷(过程3). 氢营养型产甲烷菌通过种间氢电子转移途径产甲烷(过程4和5).所建模型的详细动力学过程和化学计量比如表2所示.

1.3.3敏感性分析

为了确定乙酸厌氧产甲烷过程中最敏感的参数，进行了参数敏感性分析. 分析了最大比底物摄取速率，包括km_Xac(最大比乙酸裂解速率)、km_Xst(最大比乙酸氧化速率)、km_Xh2(最大比氢型产甲烷速率)、km_DIET(最大比电子消耗速率)及对应的半饱和常数(Ks). 以甲烷浓度作为测量灵敏度的聚焦变量，选用“绝对-相对”灵敏度分析公式进行计算[19].

1.3.4参数估计

对于灵敏度分析确定的敏感参数，利用试验数据与模型模拟结果之间的加权偏差平方和最小化来估计确定[19]. 用于参数估计的试验数据为a0、a1、a3、b0、b1和b3体系的累积甲烷产量.

1.3.5模型评价

采用判定系数(R2)和泰尔不等式系数(TIC)对模型拟合效果进行了评价，用Matlab 2016软件对变量试验值与模拟值之间的拟合优度进行量化计算.R2也被称为拟合优度指数，该值越接近于1说明拟合的越好；TIC是一种高置信度的计算机仿真模型评价参数，该值小于0.3表示模拟值与实测数据吻合良好[23].

1.3.6模型验证

选择上述试验设计中两组试验(a2、b2)、Kato等[5]报道的批式试验〔c(乙酸钠)为20 mmolL，浓度为1 550 mgL的磁铁矿〕和LI等[24]报道的试验〔c(乙酸钠)为20 mmolL，生物炭〕对修正模型的有效性进行验证. Kato等[5,24]的研究体系均以20 mmolL乙酸钠为底物进行产甲烷，分别添加磁铁矿和生物炭，将其分别命名为r1和r2.

2 结果与讨论

2.1 添加针铁矿对甲烷产生的影响

与对照组相比，添加针铁矿的体系在12～30 d产甲烷量开始迅速增加，产甲烷速率较高(见图1). 反应进行到40 d左右达到最大产甲烷量，添加针铁矿后体系累积甲烷产量没有显著性差异(P>0.05)，产气开始与结束时间均稍有提前. 结果显示，c(乙酸)分别为12和20 mmolL时，与对照组相比，外加40～2 000 mgL针铁矿能够提高产甲烷速率，最大产甲烷速率分别提高了44%和63%.

2.2 微生物群落分析

图1 针铁矿对乙酸产甲烷过程的强化作用Fig.1 Enhancement effect of goethite on acetate methanogenesis

如图2(a)所示，T78细菌相对丰度较高，隶属于Anaerolinaceae科，在该家族中鉴定的许多属都是严格厌氧细菌，以碳水化合物作为生长基质，存在于多种有机物厌氧反应体系中[25-26]. 该菌为各反应体系的优势菌种，占比均超过50%，这主要是由于接种污泥取自处理啤酒废水的厌氧反应器.Clostridium是一种典型的中温互营乙酸氧化菌，最适生长温度为37 ℃[27]，在厌氧体系中丰度较低但相对初始污泥有明显提高，Westerholm等[28]研究表明，反应器的运行条件和环境因子才是启动SAO途径的关键因素，而非高浓度乙酸氧化菌，可推测试验体系中存在SAO过程. 加入针铁矿促进了Ruminococcus细菌生长，相对丰度明显增加，为对照组的133倍，产生的氢气和甲酸在瘤胃物种的能量代谢中起重要作用[29]. 其他同乙酸代谢相关的互营氧化菌Syntrophus和消耗CO2的脱氧弧菌属互营代谢降解乙酸[30].

古菌分析结果表明，相对丰度较高的均为氢营养型产甲烷菌Methanobacterium，占已检测菌种的80%左右〔见图2(b)〕，能利用H2CO2、甲酸等底物产甲烷，不能代谢乙酸[26]，在厌氧消化器和废水中普遍存在. 对照组反应器中Methanobacterium的相对丰度高于初始污泥，结合细菌群落分析，可推断反应器中存在SAO途径. 与对照组相比，试验组中Methanosarcina丰富度明显增加. Rotaru等[31]发现MethanosarcinaBarkeri可以与Geobactermetallireducens进行直接电子传递，将CO2还原成甲烷.Methanosarcina通过与互营乙酸氧化菌耦合生长，可缓解体系中乙酸累积对产甲烷菌群和产甲烷过程产生的抑制，均衡的群落结构提高了反应器稳定性[30,32]. 上述研究结果均表明，针铁矿的添加能够强化DIET产甲烷途径. 目前，通用的ADM1模型未包含乙酸氧化过程和电子转移相关变量，并不能准确地模拟试验体系中乙酸产甲烷过程以及针铁矿对产甲烷过程的强化作用. 基于此，该研究对模型进行了修正.

图2 初始污泥、b0和b3体系中细菌、古菌的相对丰度(属水平)Fig.2 Relative abundance of bacteria and archaea in the initial sludge， b0 and b3 systems (genus level)

图3 参数敏感性指数(SI)Fig.3 Parameter sensitivity index (SI)

2.3 模型校准

2.3.1参数敏感性分析

敏感性分析结果(见图3)显示，参数km_Xac和Ks_Xac表现出较高的SI值. km_Xi和Ks_Xi是决定产甲烷速率的主要参数，分别表示产甲烷菌对底物的最大利用速率和微生物对底物的亲和力，其与底物类型、底物浓度及微生物种类密切相关[20]. 反应器中检测到的Methanosarcina可以进行乙酸裂解产甲烷，具有生长速率高的生物特性[33]. 因此，对应的km_Xac的敏感性在所有乙酸消耗参数中最大. 由图3可见，km_Xac为正值，最大SI值(11.11)出现在反应中期(24.5 d)，随后迅速降至0；与之相反，Ks_Xac的SI是负值，其变化趋势与km_Xac相反. 除上述两个明显的灵敏度参数外，与互营氧化产甲烷过程相关的参数km_DIET和km_Xst在反应中期也呈现出最高的SI值，分别为2.90和2.03，然后持续降低直到反应结束.

2.3.2参数估计

基于敏感性分析结果，该研究选取模型参数km_Xac、km_DIET、km_Xst和Ks_Xac，通过对照组(a0)试验数据进行参数估计(最大迭代次数设置为500次)，结果见表3. 其中km_Xac从初始值8校准为8.75，Ks_Xac从初始的2.34调整为3.45. Batstone等[20]列举了乙酸为底物厌氧产甲烷的动力学参数，提出km_Xac和Ks_Xac的校准值分别在0.14～19和0.17～14.53之间，该研究的校准值在其范围内. km_Xst 从初始值1.12校准为1.02，在Dwyer等[34]提出的0.037～25的范围内. km_DIET的校准值(0.78)与初始值偏差最大，明显低于LIU等[35]对乙醇为底物的上流式厌氧污泥反应器提出的推荐值(10.32)，这是由于不同底物提供电子的速率不同导致的.

表3 a0体系中动力学、化学计量参数的初始值与校准值

注：1)表示每单位浓度底物产生的微生物浓度.

目前研究[35]表明,导电材料只能促进细胞外电子传递. 为探究针铁矿对乙酸产甲烷途径的影响，利用试验组的产甲烷数据对参数km_Xst和km_DIET进行了校准. 结果表明修正模型对产甲烷过程的预测结果与试验数据非常吻合(见表4和图4). 采用原ADM1模型模拟的乙酸降解曲线〔见图4(a)〕和甲烷产生曲线〔见图4(b)〕与试验结果之间存在明显的偏差，这是由于其结构及动力学参数不适用于存在SAO产甲烷途径的乙酸厌氧消耗过程. 原ADM1模型模拟的乙酸降解、甲烷产生速率低于实际值，是由于其未包含SAO途径. 这也显示出SAO产甲烷途径的重要性.

表4 模型参数估计结果

图4 修正ADM1模型与原ADM1模型对a0体系中乙酸盐降解和甲烷产生模拟结果的比较Fig.4 Comparison of simulation results for acetate degradation and methane generation in the a0 system with the modified and original ADM1

图5 序批式厌氧消化体系试验和模型模拟的产甲烷结果Fig.5 Experimental and simulated results of methane production in batch anaerobic digestion system

2.3.3模拟与试验结果的比较

如图5和表4所示，模型拟合结果与试验测试结果基本一致，且12、20 mmolL乙酸为底物时，试验组中DIET途径的甲烷产生速率和累积甲烷产量均高于对照组. 这表明针铁矿通过强化DIET途径提高了SAO代谢速率，促进了乙酸裂解产甲烷功能微生物的生长，从而提高体系产甲烷速率.

2.3.4模型验证

修正模型对针铁矿强化体系(a2、b2)、磁铁矿强化体系(r1)及生物炭强化体系(r2)的模拟结果见图6. 各模拟组对应的R2值在0.991～0.997之间，且TIC均小于0.3，表明修正模型对针铁矿强化乙酸产甲烷过程具有较好的预测能力，且对其他导电材料(磁铁矿和生物炭)的强化体系也适用. 加入针铁矿、磁铁矿、生物炭等能够改变微生物群落组成及产甲烷菌的代谢方式[5,11-12,24]，进而提高有机酸产甲烷过程速率. 可推测各强化体系的共同作用机制是导电材料有效增强了乙酸氧化菌和产甲烷菌的种间协同作用，从而促进甲烷的生成.

注： r1试验组中S_CH4_测量值参考文献[5]； r2试验组中S_CH4_测量值参考文献[24].图6 验证体系试验和模型模拟的产甲烷结果Fig.6 Experimental and simulated results on methane production of verification system

图7 模拟计算的乙酸裂解、氢型及DIET途径产生的 甲烷对累积甲烷产量的贡献率Fig.7 The simulated contribution rates of acetoclastic methanogens, hydrogenotrophic methanogens and methane generated by DIET to the cumulative methane production

关于不同途径产甲烷贡献率的模型计算结果如图7所示，除生物炭强化体系(r2)体系外，其他体系均是乙酸裂解途径对累积甲烷产量的贡献(58.53%～85.39%)占主导. 这与产甲烷菌的生理生化特性有关.中温环境适合乙酸营养型产甲烷菌(Methanosarcina)的生长，使其表现出较强的乙酸裂解产甲烷代谢活性.

在a、b试验组中，添加针铁矿试验组DIET过程被强化，针铁矿对DIET过程的影响与其添加量呈正相关，a3和b3试验组中DIET途径产甲烷贡献率最大，分别为21.08%和21.89%，相比对照组分别提升了117.99%和73.18%. 模型计算结果显示，SAO体系产生的甲烷主要来自于DIET途径，占比为60.93%～90.97%，氢型产甲烷途径的影响较小. 因此，针铁矿的添加提高了DIET途径代谢水平，导致SAO产甲烷的贡献也有所提高.c(乙酸)为12 mmolL 时，各试验组中SAO产甲烷的贡献率分别为14.61%、23.23%、27.84%和33.71%；20 mmolL乙酸的各试验组中，SAO产甲烷的贡献率分别为20.12%、23.93%、30.12%和30.93%，a3和b3试验组中贡献率最大，相比对照组分别提升了130.73%和53.73%. 与针铁矿试验组现象相似，添加磁铁矿(r1)、生物炭(r2)试验组中也存在乙酸的互营氧化过程，其中DIET途径产甲烷的贡献率分别为27.20%和73.63%.

3 结论

a) 试验表明针铁矿添加能够有效地提高产甲烷速率，与对照组相比，12和20 mmolL乙酸试验组的最大产甲烷速率分别提高了44%和63%.

b) 基于试验数据，在ADM1模型框架中加入乙酸氧化的生化过程，引入氧化还原介质，实现了对针铁矿强化乙酸产甲烷过程的模拟. 模型预测和试验结果吻合度较高，能够较好地预测乙酸裂解、氢型、DIET产甲烷途径的贡献以及DIET过程被强化时产甲烷性能的提高. 在40～2 000 mgL范围内，针铁矿添加量与其对DIET过程的影响呈正相关，添加 2 000 mgL 针铁矿组中DIET途径产甲烷贡献最多，相比对照组分别提升了117.99%和73.18%. 针铁矿通过强化DIET的方式有效增强了SAO代谢过程，从而提高了乙酸产甲烷速率.

c) 修正的ADM1模型也能较好地描述磁铁矿和生物炭厌氧体系中甲烷的产生过程，对模拟此类厌氧消化系统具有适用性.