p38丝裂原活化蛋白激酶通路在重症急性胰腺炎中的作用

李海涛 张晓兰 陈晓燕 李达周 王蓉 江传燊 王雯

1解放军联勤保障部队第九〇〇医院消化内科，福州 350025；2福建医科大学福总临床医学院，福州 350025；3厦门大学附属东方医院，福州 350025

【提要】 将60只雄性SD大鼠分为对照组、急性坏死性胰腺炎(ANP)组、p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580干预组。结果显示，干预组大鼠胰腺病理损伤较ANP组显著减轻，p38MAPKmRNA及蛋白表达显著下调，TNF-α表达也显著下调。表明p38MAPK在ANP中发挥重要作用，抑制其表达可有效改善ANP的严重程度。

在重症监护室住院超过2周的重症急性胰腺炎(SAP)患者中，有多达25%的患者会出现严重的并发症或病死[1]。因胰腺的炎症反应受到酶介导的细胞损伤的调节，导致胰腺自身消化，释放大量炎症因子，引起全身炎症反应综合征(SIRS)[2]。细胞因子产生的一个密切相关的机制是蛋白激酶的激活[3- 4]。已有研究发现，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPKs)在SAP发病机制中扮演了重要角色。磷酸化的p38MAPK (p-p38MAPK)是活化巨噬细胞的重要促炎成分[5]。p38 MAPK磷酸化先于核转录因子-κB(NF-κB)，而抑制p38 MAPK可以阻断NF-κB磷酸化[6]，进而抑制炎细胞因子(IL-1、IL-6)的释放，改善SAP的症状[7]。本研究通过制备大鼠急性坏死性胰腺炎(acute necrotining pancretitis, ANP)模型，观察p38MAPK信号通路特异性抑制干预后p38MAPK蛋白表达及TNF- α水平的变化，探讨p38MAPK信号通路在ANP发病机制中的作用。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：清洁级雄性SD大鼠60只，体重250～300 g，购自重庆医科大学动物研究中心。在特定的无致病性条件下饲养，并提供足够的无菌水和食物。60只大鼠随机分为对照组、ANP组、p38MAPK信号通路特异性抑制SB203580干预组(干预组)，每组20只。建立模型之前，断绝大鼠食物12 h，正常提供饮水。参照文献[8]采用胆胰管逆行注射牛磺胆酸盐1.5 ml/kg方法构建ANP大鼠模型。干预组在制模前2 h尾静脉注射9.5 mg/kg的SB203580。对照组未做任何处理。制模后12、24 h分两批各处死10只大鼠，取胰腺组织，部分液氮冷冻，部分甲醛固定。

2．胰腺组织病理学检查：取造模12 h后固定的胰腺组织，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色。由3位病理医师盲法读片，对腺泡细胞坏死、间质炎症、水肿和出血程度进行评分[9]。坏死：无坏死为0分，坏死面积<5%为1分，5%～<20%为2分，>20%为3分；炎症：无炎症为0分，轻度炎症为1分，中度炎症为2分，重度炎症为3分；水肿：无或者极少为0分，小叶间隙水肿为1分，小叶内水肿为2分，胰岛呈孤立岛状为3分；实质性出血：无出血为0分，轻度出血为1分，中度出血为2分，重度出血为3分。总分最高为12分。

3．p38MAPK mRNA 表达检测：取冷冻胰腺组织，采用Trizol试剂提取组织总RNA，应用分光光度计法分析RNA的纯度及浓度。采用qRT-PCR检测组织p38MAPK mRNA 表达。先逆转录cDNA，RevertAid Reverse Transcriptase试剂盒购自美国Thermo公司，按说明书操作。再行PCR扩增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。p38MAPK正向引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′，反向引物5′-GAGCCAGTCCAAAATCCA-3′，β-actin正向引物5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，反应引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。引物序列均由Takara公司合成。PCR反应条件：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。以公式2-△△CT计算mRNA相对表达量。

4．p38MAPK蛋白表达检测：取冷冻胰腺组织，在10 mmol/L Hepes缓冲液(pH 7.5)中研磨，500 g离心去除细胞碎片，15 000 g离心后收集上清，采用Bradford法定量蛋白。取40 μg蛋白，常规行蛋白质印迹法检测p38MAPK蛋白表达。其中兔抗大鼠p38MAPK抗体购自Caymann Chemical公司，工作浓度1∶100，HRP标记小鼠抗兔IgG购自Immune Chemical公司，工作浓度1∶20。由Fluorchem FC2 型荧光剂凝胶成像系统获取条带灰度值，以目标条带与内参β- actin条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

5．ELISA法检测TNF-α水平：取上述胰腺组织上清，采用ELISA法检测上清中TNF-α水平。ELASA试剂盒(Catalog#KRC 3013)购自Biosource公司，按说明书操作，每个样本设3个复孔。上酶标仪测各孔在波长450 nm处的吸光值(A450值)。绘制标准曲线，计算各样本的TNF-α水平，取均值。

二、结果

1．胰腺病理形态改变及病理评分：对照组大鼠胰腺组织无明显病理改变；造模24 h后ANP组大鼠出现血性腹水，镜下见胰腺水肿、坏死和炎症细胞浸润；干预组胰腺组织病理学变化较ANP组显著减轻(图1)。 对照组大鼠胰腺病理评分为0分，ANP组24、48 h胰腺病理评分分别为(3.6±0.04)、(3.7±0.02)分，干预组分别为(0.23±0.01)、(0.38±0.07)分。SB203580干预后病理损伤显著减轻(P值均<0.05)。

注：ANP为急性坏死性胰腺炎

图1对照组(1A)、ANP组(1B)、干预组(1C)大鼠的胰腺组织病理改变(HE ×200)

2．胰腺组织p38MAPK mRNA、蛋白表达量变化：12 h时对照组、ANP组、干预组大鼠胰腺组织p38MAPKmRNA表达量分别为1.00±0.09、2.36±0.12、1.84±0.14，24 h时分别为0.98±0.08、2.58±0.09、1.60±0.08；12 h时对照组、ANP组、干预组大鼠胰腺组织p38MAPK蛋白表达量分别为0.28±0.04、0.65±0.08、0.37±0.03，24 h时分别为0.25±0.04、0.63±0.07、0.34±0.02(图2)。ANP组大鼠胰腺组织p38MAPKmRNA及蛋白表达量均显著高于对照组，干预组显著低于ANP组，但仍显著高于对照组，差异均有统计学意义(t值分别为28.67、42.02，8.92、25.74，15.96、17.33；13.08、14.91，10.36、12.60，5.69、6.36。P值均<0.05)。

3．胰腺组织TNF-α水平的变化：对照组大鼠胰腺组织12、24 h的TNF-α水平分别为(33.43±7.12)、(36.03±2.19)ng/L，ANP组分别为(180.38±13.42)、(220.65±18.42)ng/L，干预组分别为(110.51±12.22)、(150.29±9.22)ng/L。ANP组大鼠胰腺组织TNF- α水平显著高于对照组，干预组显著低于ANP组，但仍显著高于对照组，差异均有统计学意义(t值分别为30.98、38.20，11.38、10.39，17.34，19.23。P值均<0.05)。

注：ANP为急性坏死性胰腺炎

图2对照组、ANP组、干预组大鼠12(1～3)、24(4～6) h时胰腺组织p38MAPK蛋白表达量

讨论急性胰腺炎(AP)的早期事件包括非感染性的急性炎症阶段。细菌进入胰腺组织，并由此产生继发性炎症是随后发生的事件。胰腺实质内产生促炎细胞因子最早发生在AP发生的前30 min内[10]。早期产生的促炎细胞因子，如TNF-α和IL-1β，导致局部炎症递质的急剧上升，这些递质进入循环系统，使机体处于一个超炎症状态[11]。因此，无论何种诱因，胰腺内最初的局部器官特异性急性炎症都会转化为以多器官功能障碍为特征的全身性疾病。炎症性递质，尤其是细胞因子，在这个过程中起着重要作用。

近年来，p38MAPK通路在AP发病机制中的作用受到广泛关注[12]。尽管有研究表明，雨蛙肽诱导的大鼠AP实验中，抑制p38MAPK会进一步加重病症，提示p38MAPK可能在该模型中起保护作用，而不是有害作用[13]，但大多数研究则认为p38MAPK激活加重AP。在雨蛙肽诱导的急性水肿性胰腺炎和CDE饮食诱导的小鼠ANP中，给予p38MAPK抑制剂CNI-1493可以有效改善胰腺坏死、高淀粉酶血症、高脂血症，并上调TNF-α基因表达[14]。p38MAPK还可通过G蛋白耦联受体被激活，并通过激活核转录因子ATF-2、NF-κB等在转录水平诱导促炎症细胞因子TNF-α等产生[15]。本研究结果显示，在ANP大鼠模型中，给予SB203580干预可以有效抑制p38MAPK表达，下调TNF-α表达，减轻胰腺病理损伤程度，为p38MAPK抑制剂临床应用于SAP的治疗提供实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突