高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展

李宗波

(天津市津南医院，天津 300350)

高分辨熔解曲线分析技术(HRM)是在2002年由Utah大学Wittwer实验室和Idaho公司合作研发，它的原理是在PCR基础上加入饱和荧光染料、监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技术[1]。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的各个领域，对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。

1 高分辨熔解曲线分析技术概况

Utah大学的Wittwer实验室和Idaho公司在1997年首次提出PCR联合熔解曲线，由荧光信号变化实时监控PCR产物的技术，随后几年此方法不断改进，经历了HR-1，LightScanner和Rotor-Gene 6000等，期间也不断有其他公司研制出用于HRM分析的检测仪器，比如ABI公司、Bio-Rad公司等[2]。他们的原理都是基于PCR和熔解曲线技术的结合，检测的是PCR扩增产物中饱和荧光染料的强度，通过荧光染料的强度变化绘制熔解曲线，熔解曲线的不同形态代表着单个碱基的差异，从而判断碱基序列是否突变。此项技术成功的关键是饱和荧光染料，饱和荧光染料也经历了一系列的更新换代，由最初的SYBR Green Ⅰ到LC Green Plus，Syto9，EvaGreens等，不同染料对分析结果影响很大，有的染料不适用于杂合子变异检测，有的不适用于光谱不匹配分析仪，因此检测时应选择适用的饱和荧光染料。相较于其他分子诊断方法，HRM具有快速简便、成本低、灵活性高、敏感性高、特异性高、闭管操作等优点。

2 高分辨熔解曲线分析技术临床应用

2.1 遗传病

遗传病是指生殖细胞或受精卵的遗传物质(染色体和基因)发生突变(或畸变)所引起的疾病，包括单基因病、多基因病和染色体病三大类，染色体病又分为常染色体病和性染色体病，有学者研究表明可以通过HRM技术早期诊断遗传病。带-3蛋白(band-3)缺陷是遗传性球形红细胞增多症相关基因之一，是因红细胞膜的带-3蛋白缺陷导致红细胞由双凹圆盘形变成球形，易在被脾脏内的网状内皮系统捕获吞噬引起的，SLC4A1基因突变可引起带-3蛋白缺陷，何本进等[3]研究表明高效、准确、低成本的分子诊断方法HRM可以对SLC4A1基因进行突变筛查，从而辅助诊断遗传性球形红细胞增多症。李闪等[4]研究发现软骨发育不全与FGFR3基因Gly380Arg突变有关，软骨发育不良与FGFR3基因Asn540Lys突变有关，并针对两组基因突变建立了HRM技术的快速筛查方法。角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征的GJB2基因[5]、原发性肥大性骨关节病的HPGD基因[6]、原发性局限性皮肤淀粉样变的OSMR基因[7]等都可以采用HRM作为筛查方法。这些遗传病尚无有效的治疗手段，因此早期诊断有利于阻止缺陷儿童的出生，促进优生优育工作。

2.2 肿瘤

肿瘤是人体器官组织的正常细胞在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特征的新生物，可以分为良性和恶性两大类，恶性肿瘤浸润破坏器官的结构和功能，因而对机体产生严重影响，良性肿瘤若发生在重要器官也可产生严重后果，因此肿瘤患者的早期诊断和治疗就显得尤为重要。乳腺癌和子宫肌瘤是困扰女性的两大疾病，且近年来发病率有年轻化趋势，佘亚辉等[8]研究表明乳腺癌的发病率与BRCA1/2基因突变有关，叶军等[9]证实了MED12基因突变与子宫肌瘤有关，这两种基因突变都可以采用HRM技术进行检测，可用于高危人群的健康筛查和风险评估，为广大妇女同志带来福音。HRM技术在非小细胞肺癌治疗效果[10]、结肠癌发现及预后[11]、脑胶质瘤诊断和治疗[12]、良性前列腺增生和前列腺癌[13]、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病[14]、原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化[15]等各个方面得到广泛使用，为肿瘤患者的筛查和早期诊断提供了可能，延缓了患者生命。

2.3 糖尿病

国际糖尿病联盟预计到2035年糖尿病患者达到5.92亿[16]。有学者研究表明[17]饱和脂肪酸与糖耐量受损、高胰岛素血症和糖尿病危险性有关，而不饱和脂肪酸对糖尿病具有保护作用。脂肪酸去饱和酶(FADS)是饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸的关键酶，对体内脂肪酸代谢起关键作用。有研究表明[18]，在中年人群中△6-去饱和酶活性与糖尿病呈正相关，而△5-去饱和酶与糖尿病呈负相关，HRM小片段扩增法可用于检测去饱和酶在2型糖尿病患者中的基因分布，旨在为2型糖尿病预防诊断治疗提供依据。

2.4 细菌和真菌及病毒的鉴定及药敏

细菌感染性疾病的关键是病原菌的鉴定及药敏试验，传统的培养方法因耗时较长，无法满足临床要求。为满足临床需要，多位学者致力于使用HRM技术用于细菌的鉴定和药敏试验。Navratilova等[19]建立的PCR-HRMA方法用于分枝杆菌菌种的鉴定，鉴别能力远高于传统的表型鉴定方法，并且鉴定速度要远超过传统的鉴定方法，为结核病的快速诊断治疗提供有力依据。随着抗结核药物的不合理使用，耐药结核分枝杆菌越来越多，碱基的突变位置与抗结核药物类型有相关性，有学者研究表明[20]，异烟肼耐药的结核分枝杆菌有KatG和inhA基因突变，为临床合理用药提供了可靠依据。此后还有多种细菌采用高分辨熔解曲线分析技术得到了快速鉴定和抗菌药物的敏感性试验，如小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌的鉴别[21]、5种大肠埃希菌血清型的鉴别[22]、淋病奈瑟菌的鉴定及耐药试验[23]等等。

外阴阴道念珠菌病(VVC)是育龄期妇女的常见病，其发病率呈逐年上升趋势，并且病情极易反复，给临床诊断治疗带来很大困难，给患者造成极大痛苦。葛玮等[24]认为HRM技术可以用于阴道念珠菌的分型研究，此方法可以将致病性念珠菌鉴定到种，它比传统的鉴定方法操作简便、快速准确、稳定性好，并且实现闭管操作避免污染。

依据世界卫生组织统计，感染乙肝病毒的人数大约有20 亿以上，慢性乙肝约有3.6 亿[25]。我国是肝炎大国，慢性乙肝发病率高，并可逐渐进展成肝硬化、肝癌，不同的疾病进程药物治疗的差异很大[26]。杨旭洁等[27]应用HRM技术检测慢性乙肝、乙肝肝硬化和乙肝肝癌患者血液中的CYP3A5等位基因GG，AG和AA以及MDR1 C3435T等位基因CT，CC，研究表明[27]CYP3A5等位A基因与肝硬化和肝癌有正相关性，MDR1 C3435T基因多态性与患者对化疗药物的反应、疾病的易感性和临床表现有关，为疾病的鉴别诊断和治疗提供了理论依据。

2.5 药物

种子类和谷物芽类药材是中药材重要的组成部分，因体积小、形态相近，肉眼难以分辨，极易混淆，另外为了谋取利益，一些不法商家故意在药材中掺假，导致有些患者疗效不佳，甚至出现严重的不良反应，给患者及家属带来痛苦。为了解决这些问题，Osathanunkul等[28]利用HRM技术检测种子类和谷物类药材的DNA，与中药材DNA条形码数据库比较来鉴别药材的真假，为临床安全准确用药提供了依据。人参和西洋参属于名贵药材，价格昂贵，市场上仿冒的特别多，作为普通的消费者很难区分其真伪，有学者[29]将HRM技术应用于人参和西洋参的鉴定，与中国中医科学院中药研究所研究员的鉴定结果一致，收到了很好的效果。陈康等[30]在鉴定鹿茸分子及Sahachat[31]和Aliki等[32]在中草药鉴定中也都应用过此方法，说明HRM技术在中药真伪鉴定中是一种可信的鉴定方法。

3 展 望

高分辨熔解曲线分析技术具有操作简便、高通量、快速、低成本、全程闭管操作无污染等优点，在遗传病和肿瘤的早期诊断、细菌真菌的分型鉴定、药敏和药物鉴定方面有很好的应用价值。但是也有其自身的局限性，比如不能用于RNA的检测、碱基变异鉴别能力较弱、只能检测小片段扩增产物、无法区分熔解曲线相似的变异等，但随着各个方面的改进及多种实验技术的联合应用，高分辨熔解曲线分析技术一定会成为精准高效的应用平台。