调环酸钙协同硝酸钙控制采后富士苹果苦痘病

彭 勇，王君晓，马玉荣，刘 佩，王庆国*

（山东农业大学食品科学与工程学院，国家苹果工程技术研究中心，山东 泰安 271018）

苹果苦痘病是发生在成熟期及其贮藏过程中的一种生理性病害，其症状是果实的花萼端外皮层局部凹陷，形成褐色的斑点，果肉组织死亡，造成果皮组织凹陷[1-3]。苹果苦痘病显著影响苹果的贮藏品质和商品价值，造成巨大的经济损失，制约了苹果产业的发展[4]。

许多学者发现苹果苦痘病与组织钙元素失调，尤其是与缺钙有关，其病症的发生常伴随果实的低钙含量[1]。然而，近年来的研究发现，较低的总钙含量与苦痘病的发生率不完全正相关[4-5]。而苦痘病的发生却与果实内部水溶性钙、果胶钙、磷酸钙等各种形态钙在细胞内的分布及转化有关。陈见晖等[3]研究发现苹果贮藏期间，生理活性钙（水溶性钙和果胶钙）向非生理活性钙（磷酸钙和草酸钙等）的无效化转变是导致果实生理失调的重要原因之一。钙作为细胞内的重要组分及调节物质，有着重要的生理功能，细胞内调节钙的物质都有可能与苦痘病的发生有关[6]。Falchi等[4]研究发现，脱落酸处理可降低苹果果实苦痘病的发病率，并且能够降低钙反向转运体、钙依赖蛋白激酶、焦磷酸酶等钙相关酶的基因表达。因此，为了预防苹果苦痘病的发生，钙的调控仍是当前研究的热点之一。

外源钙处理在改善果实抗病性方面具有重要作用。硝酸钙是一种含有硝态氮的钙肥，可以快速补充树体内钙素的缺乏，有利于提高果实的硬度、改善品质。生产上，采前施用硝酸钙可以增加果实组织中的钙含量，预防采后苹果苦痘病的发生[7-8]，裴健翔等[9]研究发现，采后浸硝酸钙处理也可以提高苹果的硬度，抑制多聚半乳糖醛酸酶的活性和纤维素的降解，维持果实较高的品质。调环酸钙作为一种新型植物生长调节剂，可以抑制赤霉素（gibberellin，GA）的合成，抑制GA19和GA20的活性，抑制茎和叶片的生长，并使植物具有较好的抗病害能力[10]。在对葡萄的研究中发现，调环酸钙可以抑制葡萄树梢的生长，缩短节间长度，并且可以抑制葡萄果实的膨大[11-12]。Freitas等[13]通过GA和调环酸钙喷洒番茄实验发现，喷洒GA的果实，100%患蒂腐病，质外体中的水溶性钙含量低，膜质裂解程度高；而喷洒调环酸钙的果实，蒂腐病的发病率降低，质外体中的水溶性钙离子含量更高。然而，对于调环酸钙调控苹果苦痘病的研究较少，对于调环酸钙复配钙离子调控苹果苦痘病也鲜有报道。

本研究以苦痘病发病率较高的富士苹果为试材，利用采后水压浸钙方法，通过调环酸钙、硝酸钙等处理，探讨调环酸钙协同硝酸钙控制苹果苦痘病的原因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用富士苹果于2016年10月23日采购于山东省威海市文登区管理良好的果园，果实九成熟、全红，达到商品采收标准。采摘后，当天晚上运回实验室，挑选大小均匀、无机械伤、无病虫害的果实用于实验处理。

1.2 仪器与设备

TU-1810PC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；AA-7200原子吸收分光光度计 日本岛津公司；DW-HL388超低温冰柜 中科美菱低温科技有限责任公司；PAL-1数显折光仪 日本ATAGO公司；FDK30硬度计 美国WAGNER公司；Allegra 64R高速冷冻离心机 美国Beckman有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品准备

将苹果随机分为4 组，分别用清水（对照）、调环酸钙（80 mg/L）、硝酸钙（7.08 g/L）、80 mg/L调环酸钙结合7.08 g/L硝酸钙进行处理（质量浓度的选择根据相关文献及先前的水压浸钙结果）；为了保证钙离子快速渗透至果实内部，实验采用水压浸钙的方式，水压装置为直径20 cm、高4.5 m的供水管，水深3 m，处理时间为1 min。浸钙处理结束后用纸擦干果实表面，放置纸箱内，纸箱内附有聚乙烯保鲜袋，折口于20 ℃贮藏，于处理后0、2、6、15、25 d和40 d观察取样，并测定各指标。

用于统计苦痘病发病率的果实，每个处理3 个重复，每个重复30 个果实。用于硬度和可溶性固形物质量分数测定的果实，每个处理测定18 个，每个果实测定2 次。测定其他指标时，于每个取样时间点取18 个果实，分别用削皮刀取苹果果皮内侧的外皮层1～2 mm部位，混合均匀，迅速放置液氮中冷冻，-80 ℃贮藏。

1.3.2 苦痘病发病率和患病指数的测定

发病率以苦痘病发病的数量占总数量的比例来表示。

果实患病级别：按果面的病斑个数将果实患病级数分为6 个级别，病斑个数为0、1～5、6～10、11～15、16～20 个和多于20 个时，分别对应果实的0、1、2、3、4、5 级。患病指数按公式（1）计算。

1.3.3 外皮层钙含量的测定

总钙含量的测定参照汪良驹等[14]的方法，称取5 g样品，烘干至恒质量，准确称取0.4 g干样，加入10 mL消化液（V（浓硝酸）∶V（高氯酸）＝4∶1）过夜消化，放置电炉上加热使样品消解，加入0.5 g/100 mL氧化镧溶液，摇匀，滤液存入10 mL的离心管中，用于总钙含量的测定。采用原子吸收分光光度计测定总Ca含量。

不同形态钙含量的测定参照龚云池[15]和陈见晖[3]等的方法，准确称取0.5 g冻样于15 mL离心管中，匀浆后浸提12 h，4 ℃、10 000hg离心10 min，吸取上清液，过滤后用于水溶性钙含量的测定。将残渣按上述步骤用10 mL 1 mol/L NaCl、10 mL体积分数2%冰醋酸溶液、10 mL体积分数5%盐酸溶液分别逐级浸提得到果胶钙、磷酸钙和草酸钙，采用原子吸收分光光度计测定各中形态的钙含量。

1.3.4 ABTS阳离子自由基清除能力的测定

称取0.5 g样品加入5 mL、体积分数95%乙醇提取，25 ℃超声30 min，11 000hg离心10 min后取上清液备用。将30 μL样品加入3 mL 2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）工作液（7 mmol/L ABTS溶液与4.9 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1∶1混合），再将工作液分为两部分，一部分黑暗条件保存约12～16 h，测定其在734 nm波长处的吸光度（At）；另一部分20 ℃避光反应5 min后，测定其在734 nm波长处的吸光度（Ai），对照用乙醇代替ABTS（A0）。ABTS阳离子自由基清除率按公式（2）计算。

1.3.5 超氧化物歧化酶活力的测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的测定参照赵晓梅[16]的方法并略有改动，取1 g样品，加入5 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8），冰浴提取，在4 ℃下10 000hg离心20 min，上清液即为粗酶液。反应体系：1 mL磷酸盐缓冲液、2.5 mL混合液（包括130 mmol/L甲硫氨酸、750 μmol/L氮蓝四唑、100 μmol/L EDTA-2Na）、1 mL酶液。在反应体系中加入0.5 mL 20 μmol/L核黄素，置于日光灯下反应13 min，取出后置于暗处终止反应，于560 nm波长处测定吸光度（AE）。以不照光管作为空白参比，不加酶液组为空白对照组（ACK）。定义抑制氮蓝四唑光化还原50%为一个酶活力单位。SOD活力按公式（3）计算。

式中：V表示测定样品总体积/mL；m表示样品质量/g；V1表示测定时样品液用量/mL。

1.3.6 过氧化物酶活力的测定

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参照李贤宇等[17]的方法并略有改动。准确称量1 g样品，加入1 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5），混匀后4 ℃下10 000hg离心20 min，上清液即为粗酶液。反应体系为2.5 mL反应液（含28 μL愈创木酚、19 μL过氧化氢）、1 mL酶液，对照以1 mL磷酸缓冲液代替酶液，测定反应体系470 nm波长处的吸光度，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。POD活力按公式（4）计算。

式中：m表示样品鲜质量/g；VS表示测定时取用酶液体积/mL；t表示反应时间/min；VT表示样品总体积/mL。

1.3.7 丙二醛含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量参照Duan Xuewu等[18]的方法并略有改动，准确称取1 g冻样，加入5 mL、质量分数5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，4 ℃、10 000hg离心10 min。取1 mL上清液加入3 mL反应液（0.5 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液、用10 g/100 mL的TCA溶液配制），放入沸水中煮沸20 min，冷却后分别在532 nm和600 nm波长处测定OD值，MDA含量按照公式（5）计算。

式中：V表示上清液的体积/mL；V1表示测定时所用上清液的体积/mL；m表示样品鲜质量/g。

1.3.8 硬度和可溶性固形物质量分数的测定

将不同时期取样的苹果削皮后，用FDK30硬度计测定赤道面果肉硬度，单位为kg/cm3。采用PAL-1数显折光仪测定可溶性固形物质量分数。

1.4 数据处理

用Excel统计实验数据，SigmaPlot软件作图，实验结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 22.0统计软件进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 调环酸钙协同硝酸钙处理对富士苹果苦痘病发病率和患病指数的影响

图 1 调环酸钙协同硝酸钙对富士苹果苦痘病发病率（A）和患病指数（B）的影响Fig. 1 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on bitter pit incidence (A) and index (B) of Fuji apple

由图1A可知，随贮藏时间的延长，苦痘病发病率呈上升趋势。贮藏期间，单一调环酸钙处理果实发病率与对照组果实无显著性差异（P＞0.05）。在贮藏后期，硝酸钙处理及其结合调环酸钙处理能显著降低苹果苦痘病的发病率。贮藏25 d时，硝酸钙处理及其结合调环酸钙处理的苹果果实苦痘病发生率分别比对照组低21.67%和41.67%；贮藏至40 d时，硝酸钙处理及其结合调环酸钙处理组的发病率比对照组分别低15.62%和50.00%。上述结果表明，单一调环酸钙处理对富士苹果苦痘病没有控制效果，硝酸钙及其结合调环酸钙处理控制苦痘病效果显著，且调环酸钙协同硝酸钙复合处理效果最好。

由图1B可知，随着贮藏时间的延长，不同处理组间的果实苦痘病患病指数均呈现出整体上升的趋势。在整个贮藏期间，单一调环酸钙处理组果实苦痘病患病指数与对照果实无显著差异（P＞0.05）。贮藏前25 d，果实的患病指数上升较快，同对照相比，硝酸钙和调环酸钙结合处理能够显著降低贮藏后期果实的患病指数（P＜0.05）。由此可见，单一调环酸钙处理对降低富士苹果果实苦痘病的患病指数没有效果，采后水压浸硝酸钙和与调环酸钙结合处理能够有效降低贮藏期间富士苹果果实的患病指数，且调环酸钙协同硝酸钙处理效果更好。

2.2 调环酸钙协同硝酸钙处理对富士苹果总钙含量的影响

图 2 调环酸钙协同硝酸钙对富士苹果外皮层总钙含量的影响Fig. 2 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on total calcium content of Fuji apple

由图2可知，随贮藏时间的延长，富士苹果外皮层中的总钙含量呈上升趋势。在0 d时（处理后取样），各处理组外皮层的总钙含量显著高于对照组（P＜0.05），结果表明，浸钙处理对增加外皮层中总钙含量的效果明显。在整个贮藏期间，硝酸钙和结合处理的外皮层总钙含量显著高于其他两组，且结合处理的外皮层中总钙含量显著高于硝酸钙处理，表明调环酸钙在外皮层中能够协同硝酸钙作用，促进钙离子的吸收。

2.3 调环酸钙协同硝酸钙处理对富士苹果水溶性钙、果胶钙、磷酸钙和草酸钙含量的影响

由图3A可知，贮藏期间，富士苹果外皮层中水溶性钙含量呈上升趋势。贮藏0 d时，各处理组水溶性钙含量均显著高于对照组（P＜0.05），以结合处理组水溶性钙含量最高。贮藏25 d时，硝酸钙处理组和结合处理组的水溶性钙含量达到最高值，分别比对照高8.91、9.64 μg/g。单一调环酸钙处理对增加外皮层中钙含量的效果有限。

由图3B可知，随贮藏时间的延长，外皮层中果胶钙含量呈上升趋势。与对照组相比，整个贮藏期间，单一调环酸钙处理显著降低了外皮层的果胶钙含量，而硝酸钙和结合处理显著提高果胶钙含量，并且结合处理增加果胶钙含量的效果显著高于硝酸钙处理；贮藏25 d时，结合处理组的果胶钙含量比对照组高10%（P＜0.05）。由此表明，调环酸钙能够有效地协同硝酸钙增加外皮层中的果胶钙含量，从而有效维持果实的硬度。

由图3C可知，贮藏期间，外皮层中磷酸钙含量变化较小，这与刘剑锋等[19]研究发现浸钙对磷酸钙含量没有显著影响的结果是一致的。几种处理比较来看，以结合处理的磷酸钙含量最低，而其他处理与对照差异不显著，尤其是在贮藏后期。由图3D可知，外皮层中草酸钙含量整体呈先上升后下降趋势，贮藏2 d时，硝酸钙和结合处理提高草酸钙含量的效果显著高于对照，贮藏2～25 d期间，草酸钙含量整体呈下降趋势，以结合处理的草酸钙含量最高，对保持草酸钙含量效果最好。

图 3 调环酸钙协同硝酸钙对富士苹果外皮层中水溶性钙（A）、果胶钙（B）、磷酸钙（C）和草酸钙（D）含量的影响Fig. 3 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on water soluble calcium (A), pectin calcium (B), phosphate calcium (C)and oxalate calcium (D) contents of Fuji apple

2.4 调环酸钙协同硝酸钙处理对富士苹果抗氧化活性的影响

由图4A可知，贮藏0～6 d，苹果外皮层ABTS阳离子自由基清除率呈现上升趋势，贮藏6～25 d期间，ABTS阳离子自由基清除率保持相对稳定。单一调环酸钙处理的苹果外皮层ABTS阳离子自由基清除率显著高于对照组，说明调环酸钙处理对提高外皮层的抗氧化活性具有一定的效果。在整个贮藏期间，硝酸钙处理和结合处理组的外皮层ABTS阳离子自由基清除率均显著高于对照组（P＜0.05），且结合处理组的ABTS阳离子自由基清除率最高，表明调环酸钙能够协同硝酸钙提高外皮层的抗氧化活性，降低果实遭受氧化应激损伤的可能性，保持膜的完整性。

由图4B可知，随着贮藏时间的延长，外皮层的POD活力呈现上升趋势。贮藏25 d时，硝酸钙处理和结合处理组苹果外皮层POD活力均显著高于对照组。除了第0天外，单一调环酸钙处理组POD活力在贮藏期间与对照组差异不显著。

由图4C可知，随着贮藏时间的延长，SOD活力呈先上升后下降的趋势，且在贮藏2 d达到最高值。硝酸钙处理和结合处理组的外皮层中SOD活力均显著高于对照组，并且结合处理提高SOD活力的效果明显高于硝酸钙处理，但单一的调环酸钙处理对外皮层SOD活力影响不明显。贮藏后期，SOD活力逐渐降低，可能与细胞受到损伤导致的总抗氧化能力降低有关。

由图4D可知，贮藏前期，苹果外皮层MDA含量呈现上升趋势，贮藏6～15 d，MDA含量快速增加，并且对照组和调环酸钙处理组的果实MDA含量显著高于硝酸钙处理组和结合处理组，结合处理组的MDA含量最低，表明结合处理组的果实膜质氧化程度低，果实受到的氧化损伤小。

图 4 调环酸钙协同硝酸钙对苹果ABTS阳离子自由基清除率（A）、POD活力（B）、SOD活力（C）、MDA含量（D）的影响Fig. 4 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on ABTS cation free radical scavenging activity (A), POD activity (B),SOD activity (C), and MDA content (D) of Fuji apple

2.5 调环酸钙协同硝酸钙处理对富士苹果硬度和可溶性固形物质量分数的影响

图 5 调环酸钙协同硝酸钙对富士苹果硬度（A）和可溶性固形物质量分数（B）的影响Fig. 5 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on firmness (A) and soluble solids content (B) of Fuji apple

由图5A可知，与贮藏初期相比，贮藏15 d后对照组和调环酸钙处理组硬度明显下降，对照组和调环酸钙处理组硬度下降近30%，而硝酸钙处理及结合处理组苹果果肉硬度在15 d内变化较小。这表明，硝酸钙及结合处理能够有效维持果实硬度，延缓果实衰老。

由图5B可知，贮藏0 d，各处理组苹果可溶性固形物质量分数有所差异，调环酸钙处理和其与硝酸钙结合处理组的可溶性固形物质量分数高于其他处理组，表明调环酸钙在一定程度可提高富士苹果可溶性固形物的质量分数，单独硝酸钙处理对可溶性固形物质量分数的影响不大。经过15 d贮藏，各处理组果实可溶性固形物质量分数降低，但各处理组之间没有显著性差异（P＞0.05），表明呼吸作用加速了糖类物质的消耗，导致可溶性固形物质量分数的下降。

3 讨 论

钙离子作为一种必需营养素，在调节植物的生理功能方面起着重要的作用，本研究发现调环酸钙结合硝酸钙处理可以显著降低苹果苦痘病的发病率和患病指数，效果好于单一硝酸钙处理。并且，调环酸钙结合硝酸钙处理对于提高苹果外皮层总钙含量的效果更好。研究表明采后钙离子处理可以提高果实中的钙含量，降低苦痘病的发生率，钙离子向细胞内的渗透是钙含量增加的直接原因[20-21]。但是，即使细胞内有充足的钙，仍有可能发生钙缺乏症，钙离子在细胞内的分配和转移至关重要。本实验发现钙处理后，苹果生理活性钙（水溶性钙和果胶钙）含量明显增加，尤其是调环酸钙结合硝酸钙处理组生理活性钙含量增加最为明显，这与其他学者研究发现钙离子可以增加果实内水溶性钙含量、降低钙缺乏症的发生[3,22]的结果是一致的。并且，调环酸钙结合硝酸钙处理降低了外皮层中磷酸钙含量，维持了较高的草酸钙含量。磷酸钙和草酸钙作为非生理活性钙，起到维持钙库稳定、解除毒害的作用，结合处理组中较低的磷酸钙含量表明调环酸钙和硝酸钙结合处理可以维持钙库稳定，而较高的含量草酸钙具有解毒作用。草酸钙含量与果实内的有机酸密切相关，苹果中含有较多的有机酸，会溶解细胞壁的中胶层，促使细胞裂解死亡，而钙离子会和有机酸结合形成不溶性的钙盐沉淀，从而防止有机酸含量过高对细胞的损害，这可能是结合处理组中苦痘病发生率较低的原因之一[3]，但不同种类果实钙处理的效果不同，王永博等[23]发现用硝酸钙处理梨果实能够增加果皮中草酸钙含量，对磷酸钙含量并没有显著性影响。

此外，钙离子的分配和转移涉及Ca-ATPases、Ca2+/H+转运体、Ca2+通道等的作用[24-25]，研究发现GA处理可以延长果蔬的贮藏期[26-27]，但GA诱导了较高的Ca-ATPases基因表达和活力，影响钙的分配和转移，增加了脐腐病的发生率[13,28]，而调环酸钙作为GA的抑制剂，降低了番茄脐腐病的发生率，主要原因是增加了钙离子的吸收和水溶性钙的含量，降低了Ca-ATPases基因表达，减少了质膜损伤[13]。虽然，研究表明采前叶面喷施调环酸钙对降低苦痘病的发生率有一定效果[29]，但本实验的结果发现单一调环酸钙预防富士苹果采后苦痘病的效果并不理想，对于调环酸钙抑制苹果苦痘病的机理还需要进一步的研究。

研究表明，果蔬采后钙离子处理可以维持细胞膨压，保护膜的完整性，降低膜质的氧化代谢，从而延长果蔬的贮藏寿命[21,30]。汪良驹等[14]研究表明苦痘病苹果果实的MDA含量比正常的高2 倍左右，患苦痘病苹果果实细胞膜脂氧化程度明显高于健康果实。本研究结果表明，与对照和其他处理相比，调环酸钙协同硝酸钙处理可以显著提高果实ABTS阳离子自由基清除能力，降低MDA含量，维持较高的POD和SOD活力。但是，抗氧化体系与细胞内钙含量之间的关系仍不确定，Saure[31]认为番茄脐腐病的发病不是因为缺钙，而是氧化应激损伤导致的结果。调环酸钙结合硝酸钙处理能够有效降低苹果外皮层中的MDA含量，提高果实的抗氧化活性，说明了其有利于维持细胞功能的稳定，保证钙离子的有效性，从而降低苦痘病的发生。

从果实品质指标来看，调环酸钙结合硝酸钙处理可以维持果实较高的硬度，但单独调环酸钙处理对硬度影响不大，这可能与钙离子的浓度有关。调环酸钙是否可以调节果实内可溶性固形物质量分数还需要进一步的研究。

4 结 论

采后调环酸钙结合硝酸钙处理可以显著降低苹果果实贮藏期间苦痘病的发病率和患病指数，提高果实内总钙和生理活性钙的含量，效果好于单一的硝酸钙处理。并且，调环酸钙结合硝酸钙处理可以维持果实较高的POD和SOD活力，提高果实对氧化应激损伤的防护能力，进而降低细胞膜的脂质氧化程度，维持细胞膜的完整性。