导管相关血行感染非细菌培养诊断的研究进展

翟晶岩 刘长兴

血管内置管是住院患者处置中重要的一项手段，尤其在重症加强护理病房(Intensive care unit,ICU)中，根据治疗需要常进行较多的血管置管。常见的血管内导管(Intravascular catheters，IVCs)包括中心静脉导管、外周静脉导管或外周动脉导管等多种类型[1]。IVCs不仅可直接将药物或营养液安全输送到血液中，同时也可用于血液动力学检测或侵入性血氧测量等多方面。随着医疗技术进步，IVCs在日常医疗中的地位越来越重要。根据国外报道，每年在北美IVCs使用量超过3亿，在澳大利亚每年也有大约1000万患者接受IVCs[2]。

然而由于与之相关的导管相关血行感染(Catheter-related bloodstream infections,CRBSI)处理不当可直接危及患者生命，因此CRBSI也不容忽视。在美国每年发生多达25万例的CRBSI[3]。目前CRBSI的诊断仍依赖于导管及血液的细菌培养，包括导管培养和血液培养[1]。早期准确检测出CRBSI病原体并正确治疗，对于CRBSI患者结局至关重要。近年来随着不少检验技术的进步，基于非培养的CRBSI诊断有了较大进展，因此我们综述了一些新兴的CRBSI诊断方法，以期对今后IVCs相关的医护工作提供一定帮助。

导管相关的血行感染的相关概念

导管病原菌定植指导管尖端、导管的皮下段或导管接头处的微生物>15菌落形成单位(Colony Forming Unit, CFU)[1]。血管内导管相关血流感染概念包括以下几种情况：(1) 出口部位感染：在无血流感染、无伴随的脓肿等其他感染的情况下，导管出口部位出现红肿或硬结(<2 cm)；(2) 隧道感染：在无血流感染或周围脓肿情况下，距隧道导管(如Hickman导管或Broviac导管)周围部位出现的压痛、红肿或硬结(>2 cm)；(3) 皮下囊感染：在无血流感染或周围脓肿情况下，完全植入血管的导管的皮下囊内出现脓性液体，常合并表面皮肤的自发破裂、引流或坏死[1]。

CRBSI的概念指具有发热、寒战和/或低血压的相关感染临床表现，且外周静脉血培养至少一次病原体阳性，除外导管之外其他感染。CRBSI的诊断主要依赖于导管细菌培养，且符合以下条件：导管段半定量培养>15CFU或定量培养>103CFU，且导管和血液的培养致病菌相同；或中心静脉导管抽血与外周静脉抽血的定量血培养比率>3 ∶1；中心静脉导管抽血培养与外周血培养阳性时间差值>2小时。细菌培养阳性时间与微生物总量相关，当患者感染源来自导管时，来自中心静脉导管的血液将具有更高的微生物量，因此细菌培养阳性的时间比外周血培养的时间更短。

目前微生物诊断仍以细菌培养为金标准，在鉴定微生物的同时又可进行抗生素耐药检测。但近年来，越来越多的IVC相关不可培养微生物被发现。对于大多数微生物培养呈阴性的疑似CRBSI的患者，限制了经验性的抗生素治疗。常规的平皿滚动法半定量或导管搅动或超声定量细菌培养结果，可能需要2～4天，由于培养时间较长，临床上容易错过患者的最佳治疗时机。其次，细菌培养对于生长缓慢细菌或不可培养细菌的诊断价值有限。因此开发额外诊断方法，弥补常规培养诊断的不足势在必行，其中分子生物学技术、高通量检测手段、血清标志物等都显示出了一定潜力[4]。

利用分子生物技术检测病原体

临床工作中对CRBSI的诊断速度对于后续决策和治疗至关重要。根据文献报道，目前已经开发了多种用于检测CRBSI病原体的分子生物技术。尤其在国外已经有了多种商业化的诊断检测方法，下面将对近年来的新兴技术做一介绍。

一、肽核酸-荧光原位杂交技术

肽核酸-荧光原位杂交技术(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization, PNA-FISH)是研究校多的检测血液培养阳性中具体微生物的技术之一[5]。主要利用荧光标记的肽核酸探针对某些特定细菌物种的rRNA和念珠菌的rDNA进行识别检测。对不同的微生物种类已经有了多种不同的成熟商业化检测技术，包括金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌，粪肠球菌或其他特定肠球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌和白色念珠菌。PNA-FISH需要制备细菌阳性的血涂片来进行检测，在显微镜下可见荧光标记寡核苷酸探针杂交的rRNA，测试时间需要大约2.5～3小时。与细菌培养为金标准相比，不同厂家的试剂盒的灵敏度和特异性都很高，均值接近99%和100%[6]。当然，在不同试剂盒之间也存在差异，如其中一些对于金黄色葡萄球菌的检测具有高特异性(99%)，但灵敏度低(72%)[7]。同时，这种方法也具有一定局限性，只能检测有限种类的病原体。

二、多重PCR杂交技术

目前利用多重PCR技术进行细菌类型鉴定已经成熟，其机理类似ELISA，最典型代表为德国BAG公司的HYPLEX血液检测试剂盒[8]。多重PCR技术可检测甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，粪肠球菌，大肠杆菌，产气肠杆菌，铜绿假单胞菌等多种细菌。同时也可进行细菌耐药标志物检测，如VAN基因和多个β-内酰胺酶基因。单次检测时间约为4小时，根据报道，与金标准相比，多重PCR技术鉴定致病菌具有较高的灵敏度(96.6%～100%)和特异性(92.5%～100%)[9]。显然多重PCR技术与金标准相比更具有时间优势，对临床早期治疗决策有更高价值。

三、基因芯片技术

根据报道已经有芬兰的公司研发出基于基因芯片技术专为诊断血培养阳性脓毒症患者的细菌诊断的试剂盒。基因芯片检测是基于扩增和检测50个细菌物种的gyrB，pareE和mecA基因的微阵列形式，可检测涉及脓毒症的多种常见病原体，如单核细胞增生李斯特菌，无乳链球菌和产气荚膜梭菌，鲍曼不动杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，流感嗜血杆菌，曼氏奈瑟氏菌，普通拟杆菌和多种的肠杆菌科的菌属。这种试剂盒的检测时间约为3小时。在2107个细菌培养阳性血液样本的检测中，对脓毒症患者的细菌诊断灵敏度为94%，特异度为96%，尤其对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌血症的灵敏度和特异度均为100%[10]。该测定方法的平均时间较传统培养方法快18小时，然而，到目前为止对于这项技术仍缺乏临床验证。

此外，基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱技术已用于血液培养阳性样本中细菌和真菌种类的鉴定[11]。MALDI-TOF的鉴定时间更短，但是每次只能识别一种特定微生物，无法检测混合微生物种群，同时需要传统的细菌培养和耐药检测进行支持。因此其科研价值可能大于临床应用。

显然，上述技术均存在相同限制，即多需要在已经确认为细菌培养阳性的血液后，才能进行细菌检测，并不能直接检测原始血液样本。因此，这将限制这些方法的临床应用，当然未来通过改进检测方法和步骤后直接应用于检测原始血液样本，可能会具有更大应用潜力。

不依赖血培养的病原体检测方法

由于CRBSI分子诊断均需从血液中获得高纯度基因组DNA，而血液中具有的PCR抑制剂和高表达的人类DNA对分子诊断检测具有较强的干扰作用。尽管如此，近年来仍有许多商业试剂盒在这个领域有了突破进展，不仅具有更高的检测灵敏度和更短的检测时间，而且可在常规实验室中使用。

一、基于PCR和电泳方法的检测

德国SIRSLab公司生产的VYOO试剂盒是一种基于多重PCR的检测方法。VYOO可以去除90%以上的人类DNA，从而大大提高了病原体检测的灵敏度，根据SIRSLab公司的说明，其可检测的最小微生物区间为3～10CFU/mL，可检测35种细菌(包括金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，粪肠球菌，产气链球菌，蜡样芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，阴沟肠杆菌，产氧菌，肺炎克雷伯菌，奇异变形杆菌，粘质沙雷氏菌，摩根氏菌，铜绿假单胞菌，嗜麦芽窄食链球菌，流感嗜血杆菌，脑膜炎杆菌，脆弱芽孢杆菌等)以及6种真菌(白色念珠菌、准筒子菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯念珠菌和烟曲霉)[12]。此外，还可以检测5种常见的耐药基因位点(blaSHV, blaCTX-M, mecA,vanA和vanB)。其整体检测时间约为8小时。

二、基于PCR和测序鉴定的技术

德国Molzym公司的SepsiTest是一种针对细菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因的一种PCR检测试剂盒。可通过快速扩增16S和18S rRNA基因，在4小时内检测血液中的细菌或真菌。在此基础上，对阳性扩增产物进行序列分析，并可在8～12小时内鉴定出300多种具体病原体。与传统培养金标准相比较，这种检测手段的敏感性和特异性分别为88.5%和83.5%[13]。当然这种基于PCR和测序方法也可能受到DNA污染导致结果假阳性的干扰，此外，相对检测时间较长也可能影响CRBSI的快速诊断而限制其临床推广。

三、基于实时PCR的检测方法

该分析方法主要利用针对DNA特异转录区的双荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)探针法进行检测。例如美国罗氏公司的研制的LightCycler SeptiFast Test是一种可利用多重实时PCR检测鉴定25种细菌和真菌的试剂盒。可检测出金黄色葡萄球菌，多种凝固酶阴性葡萄球菌，肺炎链球菌及其他链球菌，粪肠球菌，大肠杆菌，产气菌，阴沟肠杆菌，肺炎克雷伯菌等[14]。这种方法同样可以检测耐药基因mecA。此种方法具有一定优势：仅需要在1.5～3 mL血液样本，检测时间只有4.5～6小时。此外，由于其可实时检测，显著降低了样本被污染的风险。利用16S核糖体RNA基因PCR扩增诊断CRBSI也有报道[15]。当然此种方法也存在一定不足，当样本中病原体较少时，可能检测效能不高，同时其缺少耐药基因检测及昂贵的检测价格，可能会限制其临床应用。

四、基于宏基因组学高通量测序的检测方法

宏基因组测序是利用高通量DNA测序技术及相关的计算和统计方法进行数据分析的新兴科学。宏基因组测序可对混合微生物群落的基因组集合进行分析而无需细菌培养，此外，还可获得许多微生物群落的遗传特征。随着宏基因组测序的开展应用，也逐渐发现了许多新识别的病原体，而这些病原体在继往是无法通过细菌培养检测，此外对多菌感染性质病原体的识别也具有一定优势。然而到目前为止，根据我们的检索，利用宏基因组测序分析CRBSI的菌群的文献只有一篇，由Faria等人在2015年发表的比较健康志愿者和脓毒症患者的微生物群落[16]。当然基因组测序存在一定不足，其检测阳性并不一定表明存在导致特定感染的活的微生物存在，其诊断阈值也需要进一步开发。目前这种方法需要较多生物信息学分析的知识支持，目前仅在研究实验室中使用，可能是将来的一个有潜力的研究方向。

基于血液标记物的诊断

通过测量机体对微生物感染的反应是检测病原体的一种替代方法。生物标志物或生物标志物加细菌培养对CRBSI的诊断和治疗有一定帮助。尽管生物标记物在CRBSI的诊断中的非特异性仍然存在争议[17]，但其简便、快速、易于获得的特点也受到人们的青睐。

一、白细胞介素-6

白细胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)是由T细胞和巨噬细胞分泌的一种炎症细胞因子，可对感染性病原体和宿主损伤作出反应。由于IL-6半衰期较长，因此可在血液中稳定检测。同时由于IL-6是CRBSI的重要介质，已被用于预测CRBSI的严重程度和患者预后[18]。当然，IL-6是非特异性的生物标志物，它的水平在损伤急性期、急性胰腺炎以及肾移植患者中也会升高。因此其应用也受到较多限制。

二、C-反应蛋白

C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是一种肝脏来源的急性时相蛋白，可随IL-6的分泌而增加。炎症反应中CRP的合成开始非常迅速，在6h后血清浓度便可升高并在48h可达到峰值，但是其半衰期较短为19h，国内报道与细菌培养和药敏鉴定为诊断标准的研究中，CRP诊断CRBSI的敏感性为79.17%[19]。CRP可以在体内发挥调节补体级联反应，调节细菌吞噬功能。CRP水平同样可在心肌梗死、自身免疫性疾病等非感染性疾病中升高，因此特异性不高。不能单纯依靠CRP水平而判断CRBSI或指导抗生素治疗，但是基于CRP的多指标联合开发可能也具有一定潜力。

三、降钙素原

降钙素原(Procalcitonin,PCT)是甲状旁腺产生的无激素活性含116个氨基酸的降钙素前肽糖蛋白，生理情况下可参与体内钙水平稳态。PCT可产生各种炎症影响，包括心源性休克、创伤、烧伤、手术和感染。近些年来，PCT被认为可作为微生物感染的重要生物标志物。健康人血清中PCT水平较低，CRBSI患者的血清中PCT水平出现明显升高。据报道，PCT可作为鉴别CRBSI和全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的儿童的生物标志物。然而，据报道显示PCT对成人CRBSI和SIRS的鉴别效果却不甚理想[20]。尽管如此，ICU中CRBSI患者PCT水平持续升高患者的预后均较差，也已经证实了PCT与CRBSI相关的器官衰竭评分相关，因此PCT也是CRBSI最具有诊断潜力的生物标志物。当然仍需要更多的研究进一步在证实其作为快速诊断CRBSI的准确性和特异性。

四、髓系细胞触发受体-1

髓系细胞触发受体-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1, TREM-1)是免疫球蛋白超家族的一部分，可在细菌或真菌感染时上调。TREM-1与配体结合时可刺激细胞因子产生。值得注意的是，在非感染性炎性疾病中TREM-1上调不明显。因此近年来，TREM-1成为具有潜力的感染监测指标之一。血清可溶性TREM-1(sTREM-1)可由中性粒细胞、吞噬细胞、单核细胞中产生，并且可在人体体液中稳定存在。在一项针对44例细菌培养阳性的发热患者研究中sTREM-1对CRBSI的诊断价值，且较CRP和PCT具有更高的特异性和敏感性[21]。然而对于其指导抗生素应用仍有很大的研究前景，是今后探索的一个重要方向。

总结及展望

综上所述，目前对于CRBSI非培养诊断有了较多进展，尤其是分子生物学的进展开辟了CRBSI微生物诊断的新纪元，PNA-FISH、RT-PCR、基因芯片等多种技术可直接检测患者血液标本，极大的缩短了检测时间。此外，随着高通量测序等多种新兴技术的发展，其对CRBSI诊断及相关病原体检测、耐药信息获得具有更多优势。这些基于非培养的诊断可作为常规培养方法的补充，今后对提高患者的诊断准确率和改善患者预后可能会存在帮助，但在应用和解释这些非培养结果时，需要充分考虑相应方法的不足和局限性。我们相信随着各种新技术的不断进步和新生物标志物的出现， 未来CRBSI的诊断会变得更快、更灵敏和更经济，在临床上也将会出现更多成熟的可用于CRBSI诊断的试剂盒或商业产品。