罕见病的基因治疗应用与展望

桂怡婷 李 强 桂永浩

复旦大学附属儿科医院（上海 201102）

罕见病又称为“孤儿病”，大多病情严重且无有效治疗办法。80%的罕见病由遗传变异所引起，多为单基因遗传病。近年来，随着罕见病基因诊断技术的发展和CRISPR-Cas9等生物技术的进步，基因治疗凭借其“一次性彻底治愈”的特点，成为罕见病治疗的重点研究方向之一[1]。本文就近年来遗传性罕见病的基因治疗现状、传统基因递送技术和以CRISPR-Cas9为代表的基因编辑技术在罕见病诊断和治疗中的应用及发展作一介绍，以期为将来的生物技术改进和将基因治疗应用于更多的罕见病治疗提供参考。

1 罕见病概述

罕见病是相对常见病而提出的对一大类疾病的统称，其具体定义全球尚未统一。欧盟对罕见病的定义是，危及生命或慢性渐进性疾病，患病率低于1/2000，需要特殊手段干预的疾病。美国2002年将罕见病定义为，在美国患者数低于20 万人的疾病。2010年5 月，中华医学会医学遗传学分会在上海召开研讨会，与会专家对中国罕见病定义达成共识，在中国的患病率低于1/500 000 或新生儿发病率低于1/10000的疾病可称为罕见病。据统计，已确认的罕见病大约有7 000种，全球约有4亿人受到罕见病的影响。我国大约有1 680万罕见病患者，每年新出生超过20万人[2]。

罕见病类型较多，发病机制较为复杂，具有下列特点：①单一病种发病率和患病率低，但总体基数大；②约80%由遗传缺陷引起，50%～75%于儿童期起病[3]；③累及多系统，且病情严重，占婴儿死亡原因的35%[3]；④临床表现复杂，诊断困难，误诊率较高，确诊周期可长达5～30年[1]；⑤约5%的罕见病有治疗措施，不到1%有药可治，但费用高昂。

目前，罕见病的难诊难治问题已引起全球的重视。2017 年，国际罕见病研究联盟表示，在2027 年前实现所有罕见病患者在就医后一年内得到有效诊断和治疗[4]。我国在2018年公布《第一批罕见病名录》，共收录121 种罕见病，并在次年发布《罕见病诊疗指南》。截至2017 年1 月，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市了450种罕见病用药，涵盖491种适应证[5]。

2 基因治疗策略

基因治疗是一种通过改变人类基因来治疗和预防疾病的实验技术，在治疗遗传性疾病、肿瘤和某些 病毒感染性疾病中显示出较好的临床前景。基因编 辑技术的兴起拓宽了基因治疗在疾病中的应用，根据疾病特点选择不同的基因治疗策略是基因治疗的关键。

2.1 基因递送技术

利用合适的病毒载体使目的基因在体内以最小不良反应的剂量稳定表达的同时，达到缓解疾病症状的效果，是现今基因治疗的目标[6]。按治疗途径可将基因治疗划分为，体内和体外两种。体外基因治疗是指将患者自体细胞在体外转入目的基因后回输体内的过程，多运用整合型病毒载体（如慢病毒）将目的基因整合至细胞基因组使其在所有子代细胞中稳定表达[6]。体内基因治疗则指以局部注射的方式，将目的基因递送至体内，多运用非整合型病毒载体（如腺相关病毒）使目的基因稳定存在于胞质中，在细胞生存期内表达[6]。

反转录病毒和腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是近年来基因治疗中使用较多的病毒载体。慢病毒作为一种特殊的反转录病毒，可以装载大至8 kb的目的基因，在整合人类基因组时比γ 反转录病毒安全性更高，尤其对G0和G1期的造血干细胞具有很高的转染效率[6]，然而，成为现今向造血干细胞递送基因的常用工具[1]。不同血清型的AAV 可较特异地感染肝脏、视网膜、肌肉、中枢神经系统等不同组织，包装基因序列长度一般不超过5 kb，超过时效率骤然下降[1]。

2.2 CRISPR-Cas9基因编辑技术

与病毒载体递送基因（基因添加）不同，基因编辑可实现DNA 单个碱基的精准校正，介导基因添加、基因消融、基因校正等多种修饰[1]。簇状规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）相关Cas酶系统 是原核生物针对外来核酸特有的获得性免疫系统[7]。化脓性链球菌的CRISPR-Cas 9 系统最先重编程并用于构建 基因编辑核酸酶平台[8]，开启了继锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）和类转录激活因子核酸酶 （transcription activator-like effector nucleases，TALEN）之后的第三代基因编辑技术的研究热潮。

与ZFN 和TALEN 不同，CRISPR-Cas 9 基因编辑技术依赖于核酸的碱基配对，而非蛋白质DNA 识别[9]。其中，定制的向导RNA（guide RNA，gRNA）中末端20 bp 的特异性序列与靶DNA 结合，指引Cas 9内切酶切割DNA 双链中原间隔子相邻基序（PAM 序列5’-NGG-3’）上游的第三个碱基[8,10]。真核生物主要采用非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复断裂的DNA 双链，可使目的基因隐产生插入或缺失突变而失活[1]。为克服这一缺陷，基因治疗可利用病毒载体或裸露DNA分子引入同源性DNA修复模板[6]，可使细胞依照模板链修复点突变或者插入较长的DNA 片段[11]，产生同源性定向修复（homology directed repair，HDR），介导基因敲除、敲入、沉默。

3 罕见病基因治疗研究进展

2012 年，欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）批准首个基因治疗药物——Glybera，治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（可导致严重的胰腺炎）。截至2019年，FDA和EMA共批准6项罕见病基因治疗药物，可分别治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症、腺苷缺乏型重症联合免疫缺陷、RPE65型视网膜营养不良、β地中海贫血、帕金森病和脊髓性肌萎缩。

CRISPR-Cas9基因编辑技术凭借其“精确校正突变位点”的优势，弥补了传统基因递送技术中病毒载体的包装限制，成为罕见病基因治疗的研究热点。近年来，随着技术的不断改进，基因治疗的安全性和有效性得到提升，在多种遗传性罕见病，如血友病[12]、囊性纤维化[13]、杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）[14]、重症联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）[15]的治疗中取得突破成果。

3.1 血液及免疫系统疾病

凭借慢病毒载体对造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的高转导效率，基因治疗已成功在 10种、200余例血液系统疾病（包括血红蛋白病、原发性免疫缺陷和代谢性疾病）[6,16]的治疗中取得进展。

SCID 是一种免疫系统发育和功能严重缺陷性疾病，患儿易患重症感染而危及生命[16]。为治疗由编码白介素2 受体γ 亚基（interleukin 2 receptor subunit gamma，IL 2 RG）基因变异所致的X 连锁型SCID（SCID-X1），2019年研究人员使用cDNA两端均带有sgRNA结合序列的优化型IL2RG基因，用AAV6将其导入人CD34+HSPCs中，实现了在内源性起始密码子后的功能性插入，暂无脱靶效应和移植后不良反应，突破了早期临床试验使用反转录病毒诱发T细胞白血病的巨大风险[15]。

在最近的2项关于基因治疗镰刀型红细胞贫血临床试验中[17-18]，βA-T87Q-珠蛋白基因治疗β地中海贫血的安全性和临床治疗效果得到显著提高，得到EMA批准用于治疗12 岁或以上的非β0/β0 基因型的输血依赖β地中海贫血[17]。这种成功的治疗方法可以扩展到治疗湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征（Wiskott-Aldrich syndrome，WAS）、X连锁慢性肉芽肿病（X-linked chronic granulomatous disease，X-CGD）等更多的免疫系统疾病[19-20]。

3.2 溶酶体贮积症

溶酶体贮积症（lysosomal storage disorders，LSD）是由于基因变异导致溶酶体内酸性水解酶缺陷所致的遗传代谢性疾病，约有50余种，病情严重，多无有效治疗办法，临床上主要通过产前诊断加以预防[21]。异染性脑白质营养不良（metachromatic leukodystrophy，MLD）是溶酶体病中最常见的类型，由芳基硫酸酯酶A（arylsulfatase A，ARSA）缺陷所致，病变主要累及脑白质和周围神经。目前，研究人员正尝试将HSCs基因治疗与递送功能酶脑内结合，提高对中枢神经系统的治疗效力[16]。研究显示，将表达治疗性ARSA基因的慢病毒载体导入HSCs 再将其注入小鼠脑室中，比标准静脉注射途径获得了更高的ARSA脑表达量[21]。在一项MLD的临床试验中，9例患者在中位随访期时均获得了造血重建、基因校正细胞稳定植入、且脑脊液中ARSA 活性同治疗6 个月时效果一样好[22]，这种方法可能使更多的LSD患者受益[16]。

3.3 肝脏疾病

利用靶向肝脏的AAV病毒递送目的基因，可治疗因基因缺陷导致的肝脏代谢障碍。血友病是凝血酶缺乏所导致的出血性疾病，静脉注射编码FIX的AAV 8病毒至患者体内，可明显提高凝血因子水平，减轻血友病B 患者的出血症状。优化的FIX基因变体可使FIX的活性水平提升至30%[12]。然而对于致病基因F8的cDNA 太大的血友病A，最新临床试验采用AAV 5递送截短型Ⅷ因子的cDNA[23]，同样达到了很好的效果，增加糖皮质激素的剂量和疗程可以降低对AAV衣 壳产生的延迟免疫排斥反应，延长FIX的表达时间[24-25]。

除血友病外，不少肝脏代谢性疾病的基因治疗在动物实验中取得较好的结果。2018年，研究显示，在疾病发病早期阶段进行基因治疗，有望减少肝豆状核变性（Wilson disease，WD）的肝脏损伤和纠正其铜代谢异常[26]。同年，对糖原贮积病Ⅰa型（glycogen storage disease type Ⅰa，GSD-Ⅰa）的狗动物模型的基因治疗，改善了存活率，证实基因治疗GSD-Ⅰa的安全性和有效性[27]。

3.4 视网膜及视神经疾病

生理状态下，视网膜处于一种免疫赦免状态，因此采用视网膜下注射AAV 的方式局部递送目的基因入细胞，可有效避免抗原诱发的炎症免疫反应，是基因治疗视网膜及视神经疾病的一大优势[28-30]。2017年，基因治疗药物Luxturna 上市，可治疗由RPE65变异所致的2 型雷伯氏先天性黑朦症（Leber congenital amaurosis，LCA）。LCA 患儿在出生后即出现严重的视力丧失直至失明[28]。然而，10 型LCA 的致病基因CEP 290编码序列长达7.5 kb，正常基因拷贝超出AAV 病毒的包载能力，无法用同等方式的基因治疗。于是研究者利用CRISPR-Cas 9 基因编辑原理，通过AAV5载体将saCas9和CEP290特异性gRNA递送至感光细胞，直接将变异内含子区域整体删除或倒位，恢复了CEP290基因的正常表达[30]。

3.5 神经肌肉疾病

I型脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）是SMN1基因异常所致的新生儿急性致命性神经肌肉疾病。现主要有两种基因治疗办法，其一是利用可穿越血脑屏障的AAV9载体，以静脉注射的方式将携带的SMN1基因递送给SMA婴幼儿，受试患儿的生存时间大大延长，运动功能也得到改善[31]。其二是鞘内注射反义核苷酸药物Nusinersen，通过调节脊髓运动神经元的SMN 2基因选择性剪接代偿SMN 1基因缺失，该疗法彻底改变了儿童期SMA的传统治疗[1]，显示出较好的临床前景[32]。

CRISPR-Cas 9 基因编辑技术的成功运用使得因致病基因过大超过载体承载范围而无法运用传统基因递送方式治疗的疾病取得进展——先天性肌营养不良1A型（congenital muscular dystrophy type 1A，MDC 1 A）和DMD。2019 年7 月，加拿大多伦多儿童病医院的研究团队使用于JCRISPR-dCas9技术，通过AAV 9 将dCas 9、VP 64 转录激活子和靶向LAMA 1 启动子的gRNA 递送至MDC 1 A 疾病模型小鼠体内，上调LAMA 1基因表达，帮助MDC 1 A 动物模型小鼠恢复部分肌肉功能[33]。同样的，使用CRISPR/Cas9技术产生缩短版的抗肌萎缩蛋白，DMD 动物模型鼠在注射后长达1 年的时间内维持抗肌萎缩蛋白的表达，且无神经毒性，进一步确定了永久性基因校正治疗可行性[14]。

4 展望

随着对病毒载体安全性和有效性的提升以及CRISPR-Cas9基因编辑技术的进步，基因治疗已在较多遗传性疾病中取得突破进展，为罕见病患者带来了曙光。然而，基因治疗技术仍存在较大的改进空间，如免疫排斥、gRNA的识别范围、插入诱变和脱靶效应诱发的基因毒性等，多项研究正致力于解决问题使其获得更高的效率、特异性和安全性。

整合型载体会面临随机整合目的基因所致的插入诱变风险，诱发白血病或实体瘤等疾病的发生[34]，需要使用更安全的载体加以避免[6]。与此同时，辅助免疫调节药物可减轻体内基因治疗时载体诱发的免疫排斥反应[1]。相较于非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ），同源性定向修复（homology directed repair，HDR）的效率较低，不少研究正致力于提高其修复效率，产生更精确的基因组编辑[35]。为改进CRISPR-Cas9基因编辑技术，提高PAM序列对SpCas 9 切割位点的局限性，增大应用范围，研究人员成功改造出了识别5’-N 20-NGG[6]、NG、5'-GAA 和5'-GAT 等扩展的PAM 序列[36]，扩大了原有3 个碱基的局限性。此外，研究者设计了单链引导RNA（sgRNA）[37]，较之前具有更好的体内稳定性和识别效率，且免疫原性减低。在脱靶问题上，提高核酸酶的特异性至关重要，研究者在sgRNA的5’末端加上了设计的发夹结构（hairpin），形成的hp-sgRNA二级结构可提供空间和能量屏障，减少了sgRNA与脱靶位点的结合[38]。

近年来，发展的碱基编辑器（base editor）系统，不依赖于DNA 修复模板即可诱导从C 到T 或从G 到A的靶向转变，在不产生双链断裂的情况下单碱基编辑[39]。研究者开发了CRISPR-Cas相关碱基编辑器，并用AAV病毒载体静脉注射将其递送至小鼠体内，成功在体内校正Pahenu2基因，使苯丙酮尿症小鼠的症状得到了改善[40]，为未来实现更多疾病的体内基因治疗提供了方向。

综上所述，罕见病的基因治疗研究成果大大增加。CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用使原有因致病基因过大超出病毒载体的包装限制而不能运用基因递送方法治疗的疾病得到了突破性进展，对脑部等技术操作高难度组织的基因治疗研究也取得突破。但是，要想将基因治疗应用至临床治疗更多更广泛的遗传性罕见病，还需解决诸多问题，如改善整合基因载体和脱靶效应带来的遗传毒性、控制靶基因体内的表达量维持在有效治疗疾病水平、解决伦理问题和高昂的治疗费用等。此外，罕见病病种复杂，分型较多，众多病情严重的罕见病亟待寻找更有效的治疗办法，罕见病的基因治疗在未来依然存在很大的研究空间。随着研究的逐渐深入和问题不断解决，可期待不久的将来基因治疗在遗传性罕见病的应用定会不断取得突破，为众多罕见病患者带来福音。