神经丝轻链蛋白与多发性硬化研究进展

韩旭，马改英，徐瑞雪，张令霞，王诗，刘雪宇，陈丽萍

多发性硬化(MS)是累及CNS的免疫相关性、炎性脱髓鞘疾病[1]。MS的临床分型包括复发-缓解型MS(RRMS)、进展复发型(PRMS)、继发进展型MS(SPMS)和原发进展型MS(PPMS)。 RRMS是最常见的MS亚型，占70%以上。在疾病发作的10～15年内，大多数RRMS患者将转变为SPMS。目前诊断和疾病监测依赖于多种临床参数，这些检查不仅费时费力，而且在区分活动性RRMS和进行性疾病方面的效用也是有限的。MS炎症损伤不仅引起髓鞘脱失,还可引起轴索破坏，正在进行的轴索破坏的生物标志物对于反映疾病的阶段、预后和治疗效果具有重要的价值。CNS的轴突损伤后，释放到CSF中的神经丝轻链蛋白(NfL)成为反映轴突损伤标志有望成为MS的生物标志物。

1 神经丝蛋白(Nf)简介

Nf是神经元中间丝蛋白的成员，是神经元中细胞骨架的主要成分。哺乳动物Nf是由五种不同蛋白质的杂聚物组成，包括NfL、神经丝中链蛋白(NfM)和神经丝重链蛋白(NfH)、α-internexin和外周蛋白[2]。Nf在神经元中高度表达，为神经元提供结构支持并确定轴突口径和传导速度[3]。由于Nf是神经元中细胞骨架的主要成分，所有导致神经元和轴突损伤的疾病都可以增加Nf在CSF中水平。Rosengren等[4]在对12例肌萎缩性侧索硬化症和11例Alzheimer’s病的研究中首先将Nf用作神经元损伤的标志物。随后，Gresle等[5]在60例RRMS患者的CSF中发现了高于对照组的Nf水平，这表明这些蛋白也可用作MS疾病活动的生物标志物。随后Nf在不同的神经系统疾病中进行了广泛研究，包括卒中[6]，额颞痴呆[7]，并被认为可用作急性和慢性神经元损伤的标志物。最近，也有人提出Nf可能与副肿瘤CNS疾病[8]和周围神经系统疾病[9]有关。本综述主要侧重阐述Nf作为MS临床生物标志物。研究发现，NfL和NfH可作为MS患者潜在的生物标志物[5]。由于CSF中 NfL水平在室温下可稳定8 d，可以多次冻融不影响检测结果。对于样品稳定性来说，NfL比NfH作为轴突损伤标记物更有优势[10]。最近大多数MS研究主要集中在对NfL研究上,增加的NfL水平可反映正在进行的神经元损伤，使其成为潜在的生物标志物[11]。Chiu等[12]研究表明，α-internexin是一种特别不稳定的蛋白质，难以分离，易于降解，不太适合作为生物标志物。 另一方面，与NfL和NfH相比，NfM迄今为止尚未作为潜在的生物标志物进行广泛研究[13]。

2 NfL检测方法

大多数研究集中在检测CSF中的NfL。尽管腰椎穿刺可以直接反应CNS病情变化，但由于是侵入式检查限制了其在临床中的应用，较少侵入性的血液检测可以使患者获得更好依从性。由于神经丝是神经元特异性的标志物，并且NfL也可以通过CSF引流到血液中进入静脉血[14]，因此血清中这些蛋白质的发现反映了通过血-脑屏障的渗漏程度，有利于判断疾病的严重程度[15]。最近研究发现了使用超敏感单分子阵列(Simoa)血清NfL(sNfL)检测在MS中的价值。这种新技术比常规ELISA或电化学发光分别灵敏126倍和25倍[16-17]。Disanto等[18]通过Simoa技术发现，sNfL随着脑和脊髓中T2和钆增强(GE)病变数量的增加而逐渐增加。sNfL与大脑和脊髓的局灶性炎性MRI病变之间的明确正相关也支持神经元损伤与NfL浓度之间的关系。CSF 中NfL和sNfL之间存在强烈的正相关，CSF中NfL水平增加10%，sNfL水平增加5.9%，提示sNfL作为敏感且具有临床意义的血液生物标志物的价值，可以监测急性脑损伤或慢性神经退行性疾病和MS的治疗效果。研究进一步发现，sNfL和年龄之间成正相关，年龄每增加1岁sNfL水平增加2.2%。对于健康的个体，随着年龄的增长血清NfL浓度也相应增加[12]，但血清NfL的浓度为何随年龄的增长而增加，研究未进一步阐述。尽管以上这些研究在CSF中NfL和sNfL水平之间发现了强烈的正相关，但需更多的研究来建立一般人群的参考范围和基于NfL的预测的敏感性和特异性。

3 NfL蛋白预测MS进展生物标志物

临床孤立综合征(CIS)由单次发作的CNS炎性脱髓鞘事件组成的临床综合征。大约60%～80%的CIS患者发生MS的风险很高。早期治疗可以延迟甚至阻止CIS转化为MS。放射学孤立综合征(RIS)患者无神经系统表现，MRI中出现强烈提示MS的表现时，可考虑为RIS。大约1/3的RIS患者发病后5年内能够诊断为RRMS。视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)是CNS的自身免疫性炎症性疾病，被认为是一种亚洲的脊髓型MS，虽然这两种疾病在本质上是不同的，但目前鉴别诊断仍然具有挑战性。早期预测这些疾病转化为MS并积极地开始早期预防以及治疗非常重要。

有研究[19]发现，RIS与CIS患者的CSF中NfL浓度高于健康对照组，明显低于RRMS与PPMS患者，RIS与CIS患者CSF中NfL浓度无差异，说明NfL水平有助于评估炎症性脱髓鞘疾病的严重程度和可能的进展，但目前无法根据NfL水平区分炎症性脱髓鞘疾病MS不同阶段。又有研究[20]发现，RRMS复发时的sNFL水平高于缓解期。RRMS和NMOSD患者复发和缓解期的sNFL水平明显高于对照组，这两种疾病在复发期间的sNfL水平相当，但缓解期及缓解晚期NMOSD组sNfL水平显著高于对照组和MS患者。

与以上研究相反，一项研究[21]对CIS、MS和NMOSD患者进行CSF中NfL水平检测后结果显示，CIS、MS和NMOSD组患者CSF中NfL水平显着高于健康对照组。但是CIS、MS和NMOSD组患者CSF中NfL水平差异无统计学意义。Disanto等[22]发现健康对照组的NfL水平高于CIS患者，这可能与日常生活中发生的轻微神经损伤有关，需要进一步区分研究。该研究还进一步发现增加的sNfL水平可以作为轴突损伤的良好指标。

总体而言，虽然以上研究结果并不完全一致，但这并不能否认NfL可用作预测MS的生物标志物。造成结果不一致可能有以下几种原因：首先，研究中样本量较小可能造成实验结果的误差。其次，样本来源的不统一。以上研究中NfL来源主要在CSF、血清，样本的收集和检测方面存在误差也会造成结果的不一致。最后，检测方法的不一致，以上研究实验主要采用Simoa、ELISA方法，二者检测敏感性差距较大，也会出现结果的差异，导致结论的不同。所以今后研究需要更大规模的样本量和统一的样本采集和检测手法，以确保研究结果的准确性。

4 NfL蛋白监测药物的治疗反应生物标志物

已经获批的MS 疾病修饰治疗药物那他珠单抗、芬戈莫得、米托蒽醌、利妥昔单抗、醋酸格拉替雷(GA)、干扰素-β(IFN-β)均可不同程度地减少MS患者的复发率以及MRI 病灶。由于新型的疾病修正治疗(DMT)类药物其长期安全性未知，需要有成熟的生物学标志物对于药物疗效进行检测。现有研究表明，NfL是MS治疗反应的良好生物标志物，特别是对于DMT类药物。可以根据NfL浓度更好调节用药，选择更加适合的药物。

那他珠单抗是一种治疗MS的单克隆抗体，主要作用机制是限制CNS内淋巴细胞的浸润。Gunnarsson等[23]研究收集92例经那他珠单抗治疗的复发型MS患者治疗前前6个月及治疗后12个月后的CSF样本，CSF中NfL水平较基线降低了3倍，后期检测NfL水平与健康对照者没有显著差异。Kuhle等[24]研究也发现那他珠单抗治疗后CSF中NfL水平较基线降低了90%。以上研究结果表明，NfL水平可以预测那他珠单抗治疗中MS神经损伤的恢复程度。

芬戈莫德是鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，是第1种治疗RRMS的口服药物。Kuhle等[25]发现，相对于安慰剂组，芬戈莫德治疗的患者CSF中NfL水平显著下降，扩展残疾状况评分量表(EDSS)评分和T2病变量减少， NfL水平反应治疗效果与改善的临床症状和MRI结果相关。表明芬戈莫德对这种轴突损伤标志物的有益作用，并支持NfL作为MS治疗效果的早期指标。

米托蒽醌最初用作抗肿瘤剂。在美国已被批准用于治疗MS，包括SPMS，PRMS和恶化的RRMS。利妥昔单抗是一种抗CD20单克隆抗体，最近被批准用于治疗PPMS和PRMS。Axelsson等[26]发现在进展型MS患者中，使用米托蒽醌或利妥昔单抗治疗12～24个月后，与基线相比CSF中NfL水平降低了51%，表明CSF中NfL水平是检测疗效的潜在标志物。

GA是包含四种氨基酸的合成多肽的混合物，已广泛用于治疗RRMS。IFN-β是免疫调节细胞因子，并且用作针对RRMS的另一种治疗化合物。de Flon等[27]在瑞典3个中心将用一线GA和注射IFN-β治疗的临床稳定的75例RRMS患者转为利妥昔单抗治疗。研究结果发现，从GA或IFN-β到利妥昔单抗治疗的每例患者新发或扩大的T2病变的平均数量均减少，与基线相比CSF中平均NfL水平降低了21%。表明利妥昔单抗治疗可能比GA/IFN-β能更好地保护CNS免受不可逆的损伤，表明NfL可能作为药物治疗反应的标志物。 Novakova等[28]在对IFN-β或那他珠单抗治疗的RRMS患者的研究中发现，两个治疗组的CSF的NfL水平均较低，但那他珠单抗组与健康对照组无显著差异，IFN-β组NFL水平仍显著高于那他珠单抗组。目前尚未有研究分析从干扰素和GA，到口服DMT再到强效的单抗这些针对MS的治疗对NfL减少效果的比较，这为我们指明了今后的研究方向。

5 NfL蛋白MS预后生物标志物

Chitnis等[29]研究表明，新诊断的MS中早期血清NfL水平可以预测10年后MRI上的病变负荷和脑萎缩。Barro等[30]研究发现，NfL超过健康对照值的第90百分位数是随后1年中EDSS恶化的独立预测因子。随着NfL百分位数的增加，EDSS恶化的概率逐渐增加。NfL百分位数越高，未来脑和颈椎体积减少越明显。高sNfL水平与脑和脊髓容量损失相关。NfL水平可以实时反映神经轴突损伤，易于测量，在一定程度上可能比头颅MRI更全面和便捷。

6 小结

综上，NfL有望成为MS早期诊断，预测疾病进展和治疗效果以及预后的潜在标记物。由于引起神经元损伤的各种疾病可导致CSF中NfL浓度升高，所以NfL检测的特异性有待提高。在广泛应用于临床之前，需要更多的数据建立一般人群的正常浓度参考范围及用不同的浓度梯度区分MS的不同阶段及MS、NMOSD和MOG抗体相关脑脊髓炎。NfL检测方法需要标准化，以及在不同的地域以及种族之间测定其有效性。