干细胞用于慢性阻塞性肺疾病治疗的研究进展

彭京兰 马畅 吴晓梅

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)具有较高的发病率和死亡率，预计到2020年将成为全球疾病死亡率的第三大原因[1]，其现行治疗方案旨在缓解症状，避免急性加重，提高患者的生活质量，但不能阻止其进展或修复受损肺组织及功能，无法降低该疾病的死亡率。因此，迫切需要研究针对COPD新的治疗方法以解决此难题。

肺是由40多种不同的分化类型细胞组成的复杂器官，不同的祖细胞群位于成年人类肺的不同解剖区域(例如肺上皮干细胞)。通过动物模型实验及临床试验发现，组织特异性干细胞和骨髓来源干细胞能够促进受损伤的肺再生新的肺组织。这提示我们，通过给予外源性干/祖细胞或激活内源性干/祖细胞来达到治疗COPD的目的，是一种新的可行的治疗方案[2]。

呼吸系统的内源性干细胞种群

一、大气道干细胞的作用

肺内气管和左、右主支气管内的假复层上皮中，含有基底细胞，属于未分化的干细胞，在其表面表达CD44、CD49f、CD151、CD166、神经生长因子受体(NGFR)、表皮生长因子受体(EGFR，参与组织修复的调控)，并且在其胞质中表达细胞骨架细胞角蛋白CK5，CK14和CK17，组织因子(TF)及其胞质和/或细胞核中的蛋白 Trp-63(p63)。p63是p53家族的转录因子。p63能够拮抗 p53的功能，可以调节细胞凋亡和细胞周期，以保证基础细胞的存活和更新[3]。研究表明在人支气管基底细胞中敲除 p63 会显著降低其增殖和迁移[4]。

从功能上讲，人气管支气管上皮的基底细胞就是干细胞，因为其在体内(异种移植)和体外均可重构成完全分化的黏膜纤毛上皮。有实验证明，将人支气管基底细胞移植到被萘损伤了气管及支气管的小鼠模型中，产生了完全分化的上皮[5]。人体内的滋养层细胞表面抗原2(TROP2)是在许多癌症中高度表达的跨膜糖蛋白，具有干细胞样特性，为细胞存活和增殖提供了信号[6]，在吸烟患者中观察到，在TROP2作用下，基底细胞增殖率明显升高[7]，因此我们推测，或许可以通过TROP2促进气管、支气管基底细胞的分化再生这一方式来达到治疗COPD的目的。

有研究发现通过支气管内活检在COPD 患者的次级支气管中获得的支气管基底细胞数目(CK5+/CK14+/p63+)显着减少；而已确定为非 COPD的既往为吸烟者和/或现在为吸烟者的人群，他们的支气管中的基底干细胞计数较低，并伴有气流受限的临床特征。这可能代表了COPD 的早期诊断前阶段，表明基底干细胞衰竭与 COPD 发病机制有关[8-10]。

二、黏膜下支气管干细胞的作用

人气道黏膜下支气管腺的导管细胞也同大气道干细胞一样通过在表面表达 CK5，CK14，p63 等而具备了干细胞的分化特性。有研究人员发现，将人黏膜下支气管腺的导管细胞异种移植到大鼠气管中会产生许多具有不同分化能力的细胞，包括腺细胞[11]。已有实验能够从人的气管中分离出这种导管腺干细胞(CD166+/CD44/NGFR)[12]，另外，Swatek AM等人从肺移植所致闭塞性细支气管炎患者的尸检肺标本中获得了与导管腺干细胞相似类型的细胞(p63+，CK5+，CK14+)，并发现这些干细胞的增殖能力随着疾病的进展而下降，表明气道黏膜下干细胞的衰竭可能是肺衰竭的一种机制[13]。这提示我们导管腺细胞或可在损伤的肺组织中起到修复作用，但目前尚未有学者在 COPD 和/或肺气肿患者中对这类细胞进行相关研究。

三、支气管肺泡干细胞的作用

在肺中，支气管肺泡干细胞(BASCs)仅在支气管肺泡导管连接处发现，正常情况下处于静止状态，但在肺损伤时会发生反应性增殖。BASCs的细胞表面标志物包括：2型肺泡上皮细胞表面活性剂蛋白C(SP-C)和波形蛋白[14]、血红蛋白家族1A成员1(SCGB1A1)、干细胞抗原1(Sca-1)、CD34等。在体外将BASCs与来自人体肺内的成纤维细胞共同培养，发现再生出了新的支气管肺泡结构[14]。肺的远端气道壁中也存在干细胞，将其移植到小鼠的受损肺中，表现出自我更新能力，分化出了内胚层来源(上皮细胞)和中胚层来源(血管)的结构，并进一步产生了人细支气管、肺泡、血管等组织结构，并部分恢复了小鼠的肺实质[2]，虽然这类干细胞能够修复小鼠受损肺组织，但目前尚未有关于在COPD患者中的临床研究。

四、肺泡干细胞的作用

研究人员在小鼠模型实验中发现，肺泡上皮2型细胞(AT2)表面能够表达axin-2(这是一种调节Wnt信号通路中β-连环蛋白稳定性的蛋白，具有调节干细胞的自我更新和谱系特异性分化的作用)，并显示出了和干细胞相同的特征[15-17]，包括自我更新能力和分化为肺泡1型细胞(AT1 细胞)的能力[16]。另外，在AT2细胞表面还可发现上皮细胞粘附分子、足突细胞面膜蛋白(podoplanin，一种属于黏蛋白型蛋白的小膜糖蛋白，是肺发育特别是肺泡型成熟所必需的)等。敲除小鼠端粒酶后，AT2细胞减少，随之出现肺泡数目减少[18]，这提示AT2与肺泡的生成息息相关。肺组织中存在一种常驻肺泡干细胞，能够表达类似于人间充质干细胞(hMSCs)细胞表面标志物，并且在体外具有克隆能力，可以分化为AT2细胞，这些细胞仅位于肺泡壁中。在体外实验中，经全反式维甲酸处理的人肺泡上皮干细胞，可以进一步分化为AT1和AT2 细胞，用Am80(合成类维生素A)刺激人的肺泡干细胞也促进了其分化[19]。另外发现磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶 B(Akt)途径也参与了人肺泡干细胞的分化，主要作用机制是通过生长因子的作用进而促进细胞存活。研究发现，当给予相应的抑制剂，阻断Akt磷酸化的PI3K 途径时，可以诱导肺泡上皮干细胞分化为AT1和AT2细胞[20]。此外，在由弹性蛋白酶诱导的肺气肿的小鼠模型中，肺的Akt 磷酸化增强，使用PI3K抑制剂会导致肺泡干细胞分化[21]。

五、 肺组织间充质干细胞的作用

肺组织中存在间充质干细胞，其分泌的FGF-10(成纤维细胞生长因子10)，可以调节发育中的肺细胞分化所必需的 BMP、Wnt 和Shh信号途径，研究发现，在体外培养时，给予碱性成纤维细胞因子(bFGF) 或肝细胞生长因子(HGF)，肺间充质干细胞表现出了一定的克隆性[22]。在同一环境内进行培养时，肺间充质干细胞还能够促进气道上皮干细胞的增殖和分化。这些特性或可应用于COPD的治疗，但尚未有相关临床研究。

外源性干细胞种群的作用

目前有部分学者对外源性间充质干细胞(骨髓间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等)治疗COPD的有效性进行了深入的研究[23-25]。临床前研究表明，间充质干细胞(MSCs)可以通过抗炎，免疫调节，旁分泌和组织修复作用以及促进内源性干细胞增殖等途径参与纠正COPD造成的肺损伤。

一、 抗炎、免疫调节作用

人们对MSCs的抗炎作用在体外进行了广泛研究[26]。这些研究包括MSCs对先天性和适应性免疫系统细胞的影响，以及对蛋白酶和蛋白酶抑制剂之间平衡的调节。MSCs的免疫调节作用包括抑制T细胞和B细胞增殖，诱导调节性B细胞和T细胞并使单核细胞、巨噬细胞和树突细胞更倾向于表现为抗炎和耐受性表型。主要作用机制包括以下三种：(1)细胞之间的直接接触(例如通过 MSCs和T细胞相互作用的程序性死亡-1)(2)可以表达吲哚胺2，3-双加氧酶和促炎性介质环氧合酶2(COX2)，进而介导前列腺素 E2(PGE2)引起氨基酸和脂质代谢发生改变。(3)能够产生PGE2和分泌因子包括转化生长因子-β(TGF-β)和肝细胞生长因子。最近的数据表明，巨噬细胞吞噬凋亡的MSCs，并随后极化为另一种巨噬细胞表型，有助于其发挥免疫调节作用[27-28]。有研究发现，MSCs具有诱导弹性蛋白酶处理的肺上皮细胞分泌白细胞蛋白酶抑制剂的作用，从而使上皮细胞分泌表皮生长因子(EGF)和HGF。蛋白酶抑制剂能够阻断蛋白酶介导的组织损伤，降低保护性介质的降解。使用香烟烟雾提取物(CSE)对巨噬细胞进行处理，把处理后的巨噬细胞与MSCs进行共同培养，结果发现，MSCs增加了巨噬细胞的活力并降低COX2，白介素(IL)-6等炎症相关物质的表达，并分泌诱导了抗炎细胞因子 IL-10[29]。总体而言，MSCs的这些特性可能对COPD有益。

二、 抗菌作用

MSCs不但具有抗炎作用而且能够抗微生物[30]。其中包括通过激活其他炎症细胞分泌免疫介质以间接发挥作用，以及直接抑制作用。有实验表明，在MSCs和MSCs衍生的条件培养基中，常见的几种呼吸道病原体(如铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等)的生长速率和存活率明显降低，可能是由于MSCs能够分泌抗菌肽和免疫介质(例如 IL-6，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，IL-8和巨噬细胞迁移抑制因子)[30]。这些因子能够促使中性粒细胞聚集并提高中性粒细胞的抗菌活性。因此，MSCs的直接和间接作用都可能有助于宿主对入侵病原体的防御反应，这可能与预防或治疗 COPD 急性加重有关。

三、 旁分泌效应

MSCs经旁分泌途径，参与调解生长因子的分泌，进而影响肺组织细胞及血管内皮细胞等的再生[31]。 有研究表明给予COPD患者MSCs治疗后，其体内的HGF，EGF，VEGF等的mRNA 表达与对照组相比有所增加，损伤肺内出现了组织再生和修复[32-36]。这些生长因子被认为有助于肺组织结构的恢复，而HGF的特异性与MSCs的抗凋亡作用有关[31]。以上作用机制对治疗COPD具有指导意义。

四、 肺组织修复作用

肺气肿的组织破坏的特征是肺泡附着的丧失，而MSCs治疗可以恢复肺气肿动物模型中受损的肺泡结构。因此，我们提出MSCs在上皮细胞中的植入和转分化有助于肺气肿中破坏的肺结构的重建。有动物研究发现MSCs 在给药后 24 h之内移入肺组织，但其数量似乎很少并随时间的延长而逐渐减少[28]。尽管 MSCs的移入和保留可以增加肺损伤部位的MSCs，但实验结果并没有直接证明移入的MSCs参与了肺组织的修复。目前尚缺乏MSCs 对毁损性肺部结构重建的直接证据。但有研究表明MSCs 移植可以通过促进香烟烟雾诱导的COPD 小鼠内源性肺干细胞的增殖来修复肺损伤[25]。

临床应用及展望

虽然我们对内源性干细胞的作用机制有了一定的了解，但更详细的作用机制尚不明确，且这些内源性干细胞分化程度更高，是否有更好的干预方式可以激活其活性，促进他们向受损的肺组织分化，仍需进一步研究。另外，内源性干细胞还不易被分离获取，为相关实验研究带了巨大的挑战，若应用于临床治疗COPD尚存在局限性。与之相比，外源性干细胞作用机制相对明确，易于获取，实验技术相对成熟，且已有临床研究证明间充质干细胞不仅能够安全有效的用于COPD 的治疗，还明显提高了患者的生存质量，减少了病程中严重或致命的不良事件的发生[36-38]。虽然目前干细胞治疗COPD的临床研究还较少，仍有很多难题亟待解决，但干细胞独特的生理特性及作用机制，为COPD的治疗带来新曙光，有望降低其高死亡率。