血清核酸适配体在肺癌中的研究及其应用进展

徐爱兰 赵蕴伟

在全球范围内，肺癌是癌症发病率和死亡率的主要原因，肺癌是最常见的癌症，也是男性癌症死亡的主要原因，其次是前列腺癌和结直肠癌(发病率)以及肝癌和胃癌(死亡率)。癌症死亡的主要原因在不同国家和地区存在很大差异，这主要取决于社会经济发展程度以及相关的生活方式因素[1]。已知吸烟是导致肺癌的重要因素之一。但是人们在50岁以前，性别和吸烟这两个因素对肺癌发病发展的影响并不大。我国女性的吸烟率低，但是我国女性的肺癌的发病率很高，这可能与她们长期接触油烟、二手烟，烟雾暴露增加，以及环境的污染等因素相关[1]。在组织学分型中，肺癌主要是小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌又可分为腺癌、鳞癌和大细胞癌。肺癌的发病机制复杂，同时存在基因以及组织学方面的异质性，这些导致肺癌在治疗方面具有一定的难度。尽管多年的研究和医疗方面取得进步，肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因[2]。常规癌症治疗，如化疗和放射治疗，表现出严重的副作用，包括胃肠道不适、器官损害和低质量生活[3]。在临床中的大多数患者发现肺癌时，可能已经是中晚期阶段，所以肺癌的早期发现、早期诊断对癌症疾病的治愈具有重要意义[4]。随着分子生物学技术的进展，核酸适配体(Aptamer)作为一种新型的高亲和力、高特异性生物识别配体在生物医学基础与临床应用研究中变得越来越重要。所以本文就核酸适配体在肺癌中的研究及其应用进展的情况作一综述。

核酸适配体

一、核酸适配体的特点

核酸适配体是单链DNA(SsDNA)或RNA序列，通过指数富集(SELEX)技术系统进化配体从随机文库中选择[5-6]。它们以高亲和力和特异性与相对应的靶标结合，并且具有快速靶向肿瘤穿透的能力[7]。核酸适配体可以应用于各种疾病的治疗，尤其包括肺癌等癌症，因为它们具有很强的中和活性[8]。早在1990年，Tuerk等报道了一种新型的寡核苷酸筛选技术,该技术与 PCR 扩增相结合，在体外人工构建的短链核苷酸文库中筛选出RNA核酸适配体[9]。核酸适配体可以折叠成三维结构，可以通过形成不同的形状结合到目标上，比如有发夹的结构、呈凸环状、还有的是四角环状等，并通过形状识别对应物的方式结合到目标上，主要是通过范德华力、氢键、碱基堆积力等与靶标具有很高的特异性和亲和力[8,10]。针对核酸适配体对靶点具有高度的亲和力和特异性的特点，所以核酸适配体又称为“化学抗体”，而且它的应用范围很广，从目标检测、传递到药物应用等[11]。

二、核酸适配体与抗体的比较

有研究表明，一般在动物身上开发的单克隆抗体，这种单克隆抗体在临床应用前是人源化的[11]。因此，生产治疗性单克隆抗体需要使用非常大的哺乳动物细胞培养，而且需要在良好生产规范的条件下进行广泛的纯化，生产成本高。抗体需要体外或体内生产，这可能会增加批次之间的差异。总的来说，高生产成本、安全性和短保质期，限制了这些抗体的广泛使用[11]。所以，在许多方面，核酸适配体相对抗体来说具有多种优势，它们是中等分子大小，介于抗体和小分子之间[8]。它在体外化学合成时会减少批次之间的差异[12]，并且主要是以低成本，比单克隆抗体便宜数千倍，以及以高纯度来进行化学合成[11]，可以作为生物特异性识别分子成功地与抗体竞争，并且可以针对几乎任何靶标进行选择，而且核酸适配体具有低分子量、无毒性和非免疫原性等特点[13]。非免疫原性和无毒的原因主要是由于核酸适配体的组成部分是核酸[14-15]。与大的单克隆抗体(约150 kDa)相比，核酸适配体的一个重要优势是它们的大小(5～15 kDa)[16]。因为核酸适配体比抗体小得多，所以核酸适配体具有更好的组织穿透能力以及更强的肿瘤组织内化能力[12,17]。而且，核酸适配体分子量小，可以结合那些较大的抗体无法发现的隐藏的表位[18]。

三、核酸适配体的筛选

核酸适配体的体外筛选的方式是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)产生的。核酸适配体的SELEX筛选技术发展很迅速。比如混合SELEX[19]、消减SELEX、毛细管电泳SELEX[20]等。由于核酸适配体是通过指数富集的配体的系统进化(SELEX)产生的，所以核酸适配体对靶目标具有高度的亲和力和特异性。核酸适配体的产生需要经历反复的孵化、洗涤、分离、扩增的一系列步骤[21]。最初的文库由随机的RNA和DNA分子组成，与目标物、生物标记物、蛋白质甚至整个细胞一起培养孵育。在孵育后，洗去未结合的序列，来分离和分离结合的序列。将结合序列从目标中洗脱出来，用聚合酶联反应(PCR)(基于RNA的逆转录PCR)进行扩增，这样可以产生序列丰富的序列库[18]。产生的序列库要经历一轮又一轮的选择和扩增等循环步骤，每一轮的循环都会降低序列库的异质性来进一步增加核酸适配体的亲和力和特异性[18]，在进行亲和力分析后，把具有最好的亲和力和特异性的序列池进行克隆和测序，或者进行下一代测序，来确保核酸适配体的敏感性和特异性。

四、核酸适配体的修饰

核酸适配体在实际应用中有一些局限性。在人血清中，由于核酸酶的存在，未经修饰的RNA和DNA核酸适配体都容易降解，其中RNA更敏感，因为核糖位置有20个羟基[18,21]。所以人体血清中的核酸酶加大对核酸适配体降解的敏感性，由于核酸适配体是相对较小的分子(5～15 kDa)，它们很容易被肾脏排泄[15]。这些问题都制约着核酸适配体的进一步研究及应用。

随着核酸化学的发展，可以进一步对核酸适配体进行合成和修饰，增强对肺腺癌等恶性肿瘤具有高度特异性的分子显像功能，增加选择性和特异性，以及与癌症生物标记物结合的能力，更有助于靶向成像[22]。防止核酸外切酶降解核酸适配体的一种常见方法是限制核酸链的30和/或50端[23]，研究延缓核酸适配体从血液中排泄，以及改善它的药代动力学的解决方案是与胆固醇或聚乙二醇结合，称为聚乙二醇化，通过二者结合来增加低分子物质的血清保留时间[15,24]。为了增加对核酸内切酶介导的降解的稳定性，可以用硫取代磷酸骨架来修饰核苷酸间连接，创建硫代磷酸键，增加核酸适配体的稳定性[24-25]。RNA核酸适配体，可以通过修饰核糖的高度核酸酶敏感的20-羟基来增加血清半衰期和核糖核酸酶抗性[18,21]，这些修饰包括用氟(F)、烷基、氨基(NH2)或硫基取代20-羟基。修饰的核苷酸可以在SELEX的筛选过程之前或者之后进行，因为修饰的核苷酸和SELEX的步骤不能同时进行，而且在筛选之后的修饰更容易、更便宜，但可能会对核酸适配体的结合属性和功能产生一定的影响[22]。

核酸适配体的递送系统

核酸适配体在临床治疗及应用中的研究越来越深入，核酸适配体需要相应的递送系统来发挥其治疗作用。

在之前的报道中，mRNA-29b在mRNA 29家族中表达最丰富[26]。mRNA-29b通过控制细胞分化、凋亡和增殖在肺癌治疗中发挥关键作用[27-30]。mRNA 29b在肺癌细胞中下调或者沉默，可以抑制肿瘤生长，所以mRNA 29b是一种很大潜力的癌症候选基因。但是，它们的治疗应用由于缺乏有效的递送系统而受到限制。所以，Wu[31]等人利用合成的CuO(氧化铜)纳米颗粒开发了一种新的核酸适配体连接的杂交递送系统，利用香鞘提取物制备CuO纳米粒子，将CuO纳米颗粒与MUC1(粘蛋白1)核酸适配体偶联，体外将miRNA29b导入肺癌细胞。将miRNA-29b递送到A549细胞。这种递送系统可以有效地将miRNAs递送到癌细胞，成为细胞内传递miRNA的有效平台，进一步改善肺癌的治疗结果。此外，Perepelyuk[32]等人研究的是核酸适配体-杂化纳米颗粒生物偶联递送系统，同样是选择性地将miRNA-29b递送到表达MUC1(粘蛋白1)的癌细胞。因为MUC1是一种跨膜蛋白，在NSCLC(非小细胞肺癌)中异常过表达[33],在大约80%的肺腺癌中过表达。所以可以利用它在NSCLC中的过表达，通过将MUC1核酸适配体偶联到混合纳米颗粒表面，实现miRNA-29b对NSCLC的最佳靶向治疗。Rab蛋白是调节细胞内受体转运的GTPase家族之一，MUC-1核酸适配体是NSCLC A549细胞强有力的结合配体，在Liu[34]等人的研究中，利用精确定制的DNA棱镜将GTPase Rab26作为新的潜在治疗靶点用于肺癌的靶向治疗。通过设计合成了一种具有可调靶向和siRNA负载能力的DNA棱镜平台。通过交换两个短的单链DNA，核酸适配体和siRNA的数目和位置都可以在每个纳米棱镜的1到6之间调节。因为MUC-1核酸适配体是NSCLC A549细胞的结合配体，其靶向效率与棱镜结构上的核酸适配体数目呈正相关。精确控制纳米结构上核酸适配体的能力对开发靶向递送系统起着重要作用。所以在研究中，Rab26siRNA与MUC-1核酸适配体联合应用对非小细胞肺癌(NSCLC)具有良好的抗肿瘤作用[34]。肺癌干细胞(CSCs)被认为是肺癌的种子细胞，CD133是肺CSCs的标志物，在Huang[35]等人的研究中，通过DSPE-PEG2000制成的纳米胶束作为药物输送系统，增加吉非替尼的溶解性和对肺CSCs的靶向性。该团队[35]开发了载吉非替尼的聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺纳米胶束和CD133核酸适配体(M-Gef-CD133)来消除CD133+的肺CSCs。通过研究，M-Gef-CD133能有效地将吉非替尼转运至CD133+肺CSCs，并诱导对CD133+肺CSCs的选择性杀伤作用[35]。APT是单链寡核苷酸的核酸适配体，是肿瘤细胞靶向的优良核酸适配体，S15-APTs是一种有效的肿瘤细胞靶向配体，即单链寡核苷酸为基础的S15核酸适配体(S15-APTs)，S15-APTs修饰纳米颗粒(NPs)，可以实现选择性的NSCLC靶向。APT修饰的量子点对靶细胞A549具有选择性结合和内化作用[36]。针对APT作为主动药物靶向肿瘤细胞的应用，Engelberg[36]等人研究了S15-APT内化到人非小细胞肺癌A549细胞的机制，即人类NSCLC细胞选择性内化这些S15-APT量子点是通过经典的依赖于笼蛋白的受体介导的内吞作用实现的。这一发现可用于开发基于S15 APT修饰的NPs的主动靶向给药和诊断系统，这些NPs可以通过受体介导的内吞作用选择性地进入NSCLC，从而绕过MDR(多重耐药)外排转运体，这些新的发现对于APT靶向药物传递NPs具有重要的意义。生物相容性嵌段共聚物peg-pcl包埋疏水性化疗药物紫杉醇(Ptx)的NPs，该纳米颗粒以人NSCLC细胞为靶点，它的基础是聚乙二醇(PEG)与聚己内酯(PCL)形成PEG-PCL胶束，并以APTS为靶向基团[37]。这些APT-NPs选择性地将PTX靶向NSCLC A549细胞，对人A549非小细胞肺癌细胞有较高的选择性，以及较强的杀灭作用。所以通过研究表明，这些修饰的纳米粒在不损害正常组织的情况下，在选择性靶向和根除人类非小细胞肺癌细胞方面具有巨大的临床前景[37]。

核酸适配体在临床医学中的应用

通过SELEX技术筛选得到的高亲和力和特异性的核酸适配体，由于自身相对于抗体来说对环境温度更加稳定、无毒、非免疫原性，以及具有更强的肿瘤组织穿透能力，在从治疗、药物递送、诊断、功能基因组学到生物传感等多种应用中的潜力越来越突出。

一、核酸适配体作为传感元件

在Bashmakova[13]等人的研究中，主要以DNA核酸适配体作为发光传感元件，以高灵敏度和特异性去区分肺癌患者和健康病例，它主要以重组Ca2+(钙离子)调节的光蛋白(obelin)作为高灵敏的生物发光报告分子，来检测肺部血液中的肿瘤元素。该研究也表明了核酸适配体作为发光传感元件在肺癌检测方面的应用价值很大，以及在未来的研究中将会有更大的潜力。

二、核酸适配体作为载体

Abnous[38]等人通过在研究中发现两种核酸适配体组成的十字形DNA纳米结构，这两种核酸适配体是AS1411(26聚体DNA核酸适配体)和FOXM1(ssDNA核酸适配体与Forkhead Box蛋白M1结合)，这种十字纳米结构有助于将抗癌药物阿霉素(Dox)靶向传递给癌细胞，同时减少对非靶细胞的损害和毒性作用。而且还表明FOXM1蛋白的过表达与肿瘤的发生、转移和细胞增殖有关[38].

三、核酸适配体作为靶向及放射性药物

靶向癌症治疗可以提高治疗选择性和疗效。在Russo[39]等人的研究中，将核酸适配体miR-34c和核酸适配体GL21.T相结合，二者的结合对非小细胞肺癌细胞增殖有一定的影响。核酸适配体(GL21.T)，结合并抑制AXL(跨膜受体酪氨酸激酶家族(RT Ks)的Axl亚家族)跨膜受体。而且，将miR-34c偶联到GL21.T核酸适配体作为靶向部分，以选择性传递给表达AXL的NSCLC细胞，可以影响NSCLC细胞增殖，并能够通过靶向AXL受体克服了获得性RTK(受体型酪氨酸激酶)抑制剂的耐药性。因此，GL21.T/miR-34c嵌合体在转录水平上对AXL具有双重抑制作用，是治疗NSCLC的一种新的治疗工具[39]。

在Hamamoto[8]等人研究得出了FGF2(成纤维细胞生长因子2)核酸适配体抑制FGF2-FGFR途径驱动的肺癌细胞生长，即FGF2核酸适配体对FGF2依赖性肺癌细胞的治疗是有效的，这些发现提供了临床前的证据，证明核酸适配体对癌症的治疗是有作用的，并且在临床的应用潜力很大。

Zhao等人的团队已经为A549腺癌(非小细胞肺癌最常见的亚型)开发了S6核酸适配体探针[40]，核酸适配体探针对NSCLC腺癌和NSCLC大细胞癌细胞有选择性结合，但与正常细胞的结合特性很小。这对于检测癌细胞很重要。Zhang[41]等人的研究采用抗A549肺癌细胞的核酸适配体S6对浆膜腔积液中的癌细胞进行分化，而且研究证实细胞特异性核酸适配体可成功应用于ICC(免疫细胞化学)快速诊断腺癌细胞，它具有更高的特异性和敏感度。

在Nuzzo[42]等人的研究中提供了由核酸适配体(GL21.T)和miR-137组成的核酸适配体-microRNA(MiR)复合物(AMIC)，该核酸适配体能够结合和拮抗致癌受体Axl，减少细胞迁移和肿瘤生长的能力。通过研究表明，GL21.T-137复合物能有效抑制NSCLC小鼠移植瘤的体内生长。并且GL21.T-137复合物在癌症治疗中具有广泛的适用性，是治疗非小细胞肺癌的潜在工具。

Zhou[43]等人通过SELEX细胞产生的核酸适配体作用于小细胞肺癌(SCLC)细胞，鉴定出了一种新的小细胞肺癌蛋白生物标记物，即高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)。在该研究中的免疫组化的结果显示小细胞肺癌组织中的HDLBP水平升高。用核酸适配体siRNA抑制HDLBP的表达，从而在体外抑制了SCLC细胞的增值和转移，在体内抑制了肿瘤的形成，并且抑制HDLBP的表达可以使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，抑制小细胞肺癌的进展[43]。

展 望

核酸适配体因为具有高度亲和力、高特异性等特点，使其在临床肿瘤的诊断和治疗中的作用越来越突出。核酸适配体介导的靶向给药系统也会随着研究的进一步发展，在疾病的治疗中发挥至关重要的作用。核酸适配体现已成为生物医学研究和药物筛选等领域中的重要工具，在疾病临床诊断与治疗方面已经有了一些实际的应用并具有巨大的潜能，以及随着 SELEX 的技术不断完善和化学修饰方法的进步，将会有越来越多的针对肿瘤治疗与诊断的核酸适配体从实验室应用于临床。