环状RNA在儿童常见恶性实体肿瘤中的研究进展

尉嘉斌 鹿洪亭

儿童恶性肿瘤严重危害儿童健康[1,2]。circRNA最早由Sanger[3]于1976年在RNA病毒中发现。随着高通量测序技术的迅速发展，Salzman[4]在2012年首次通过RNA测序方法在人类白细胞中检测到了80多种circRNA。随后，Jeck等[5]在人类纤维母细胞中发现了超过25 000种circRNA，如此庞大的数据提示circRNA并不是RNA剪接过程中的偶然产物，而是广泛、稳定、高度保守地存在于人类细胞中。

一、circRNA概述

(一)circRNA分子特征

circRNA是一类稳定的非编码RNA分子，大多存在于真核细胞的细胞质中，但少部分内含子来源的circRNA存在于核内。传统的线性RNA含有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，但circRNA分子呈闭合环状结构，不含有5’和3’末端，表达更稳定，不易被核酸内切酶降解[6]。

(二)circRNA的分类

circRNA大部分由外显子反向剪接形成，但也有小部分是由内含子和基因间区域形成的。根据其来源分为：外显子环状RNA(exonic circRNAs)、 内含子环状RNA (intronic circRNAs)、外显子-内含子环状RNA(exon-intron circRNAs)等，具体形成机制尚不明确[7-9]。除此之外，还有一种特殊类型的circRNA,称为tricRNA，是由前体tRNA剪接形成[10]。研究发现，其表达具有年龄依赖性及组织特异性。另一种分类是根据circRNA与相邻编码RNA的位置不同，又可以将其分为以下5种类型。“exonic”由外显子剪切而成；“intronic”由内含子剪切而成；“antisense”指circRNA基因位点与线性RNA重合，由反义链转录而来；“sense overlaping”指circRNA与线性RNA转录自相同的基因位点，但不属于外显子型或内含子型；“intergenic”指circRNA基因位点位于己知基因外[11,12]。

(三)circRNA的生物学功能

1. miRNA海绵作用 circRNA通过碱基互补作用,像海绵一样吸附miRNA，这种作用形式被称为miRNA 海绵作用。2013年，Nature上发文报道CDR1基因起源的circRNA(ciRS-7)可以结合吸附miR-7，使miR-7的活性降低，间接上调miR-7相关靶基因的表达[13]。Zheng[14]通过试验发现circHIPK3可直接结合miR-124并抑制其活性。近年来，大量研究证实circRNA的miRNA海绵作用在多种组织及细胞系中普遍存在。由于circRNA结构稳定，在机体内miRNA的吸附能力要强于线性RNA。

2. 转录调控 转录调控是circRNA一个重要的功能。为了研究circRNA对转录机制的调控，Li等[9]采用交联免疫沉淀法在HeLa细胞中鉴定出111个与RNA聚合酶Ⅱ相互作用的circRNA，并对其中的circEIF3J和circPAIP2进行功能实验，结果发现在HeLa及HEK293细胞中敲除circEIF3J和circPAIP2，可降低亲本基因EIF3JhePAIP2的mRNA水平。再如，在小鼠中Fmn基因是肢体发育所必需的。外显子circRNA是通过反向剪接从Fmn基因转录产生的。缺乏这种剪接受体的小鼠不能检测到外显子circRNA的表达，虽有正常的肢体发育，但会出现一种不完全穿透性肾发育不全表型[15]。circRNA通过阻断翻译的起始位点，进而减少蛋白质的表达。

3. 与RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)相互作用 研究发现circRNA可以与RBP直接结合形成RNA蛋白复合物,对RBP起调节作用或者通过部分碱基互补配对直接作用于靶基因,也可通过RNA介导间接与蛋白质发生关联，影响蛋白质功能[16]。例如，circRNA可以稳定地与AGO蛋白和RNA聚合酶Ⅱ结合，通过加强其功能进而提高基因转录水平。也有人提出，circRNA可作为靶向元件，同时与RNA结合蛋白及与其互补的RNA或DNA序列结合[7]。剪接因子MBL就是一种RBP，在人类和果蝇中可结合其亲本基因的第二外显子促进其环化形成circMBL。circMBL能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少circMBL生成[17]。

4. 参与蛋白质翻译 部分circRNA可以编码蛋白质。存在于哺乳动物细胞中的肝炎δ因子就是一种由circRNA编码的蛋白质[18]。研究发现，人骨肉瘤细胞U20S内的circRNA具有蛋白质翻译功能，但效率较低[19]。Legnini等[20]报道,circ-ZNF609与多聚核糖体结合,通过不依赖 5′端帽子结构的方式和剪接依赖两种形式参与蛋白质的转录和翻译。

二、circRNA与儿童常见恶性实体肿瘤

1. 骨肉瘤 骨肉瘤(osteosarcoma)也叫成骨肉瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约占所有小儿肿瘤的5%。有研究发现，circRNA_100876的下调可显著抑制骨肉瘤细胞的生长[21]。Liu等[22]通过基因芯片分析发现，hsa_circRNA_103801在骨肉瘤细胞株和组织中表达均上调，而hsa_circRNA_104980则下调。功能实验发现hsa_circRNA_103801参与HIF-1、VEGF、血管再生通路、RAP1信号通路、PI3K-Akt信号通路；而hsa_circRNA_104980与紧密结合途径有关。Wu等[23]研究发现，circTAD2A在骨肉瘤组织和细胞系中的表达显著增加，circTAD2A通过“吸附”mi-203a-3p和CREB3(与骨肉瘤相关的致癌基因)促进骨肉瘤的发生及转移，这提示circTAD2A-miR-203a-3p/CREB3可以作为治疗骨肉瘤的新靶点。越来越多的数据表明，circRNA与骨肉瘤的发生和发展呈正相关。例如，circRNALRP6通过对KLF2和APC水平的负面影响而促进骨肉瘤的发生[24]。circRNA_100876通过吸附miRNA-136抑制骨肉瘤细胞增殖[21]。circ_0000285通过“海绵”miRNA-599促进骨肉瘤的进展[25]。

2. 肝母细胞瘤 肝母细胞瘤(hepatoblastoma)是一种恶性胚胎肿瘤，是儿童肝脏肿瘤常见类型之一。Liu等[26]分别取肝母细胞瘤和邻近的癌旁组织，通过基因测序检测出两样本之间表达差异的circRNA。其中，肝母细胞瘤组织中circ_0015756的表达显著上调。经功能实验发现，circ_0015756充当miR-1250-3p海绵来调节肝母细胞瘤细胞功能。circ_0015756沉默可降低肝母细胞瘤细胞活力、增殖能力和体外侵袭能力。其团队还测定了circ_0015756在肝母细胞瘤患者外周血中的表达情况，结果显示其表达水平显著增加。Zhen等[27]也在64例肝切除患者肝母细胞瘤组织与正常肝组织的比较中发现，circHMGCS1在肝母细胞瘤组织中显著上调，circHMGCS1通过“海绵”miR-503-5p调节IGF2和IGF1R的表达，并影响下游PI3K-Akt信号通路，调节肝母细胞瘤的细胞增殖和谷氨酰胺降解。这提示circHMGCS1对于肝母细胞瘤来说可能成为一种有前景的治疗靶点和预后标志。

3. 神经母细胞瘤 神经母细胞瘤(neuroblastoma)是儿童最常见的颅外肿瘤，属于神经内分泌性肿瘤，可以起源于交感神经系统的任意神经脊部位。Chen等[16]发现circAGO2在神经母细胞瘤组织和细胞系中的表达水平上调，他们推测circAGO2可能与癌细胞的生长、侵袭和转移有关。最终他们通过实验证明了circAGO2与癌细胞中的HuR相互作用并激活HuR蛋白，通过促进AGO2-miRNA复合物的HuR抑制功能，使AGO2-miRNA介导的基因沉默受到抑制，使目标基因表达增加，从而促进肿瘤的发生和侵袭。这说明circAGO2可能会为神经母细胞瘤的诊断提供新的思路。该团队进一步探讨了circAGO2敲除对荷瘤裸鼠转移瘤生长和存活的治疗效果。在癌症转移的治疗实验中，敲除的裸鼠存活概率提高。虽然目前仅仅停留在实验阶段，但仍提示circRNA对神经母细胞瘤的预后有着重要的作用。Li等[28]通过实验研究发现，由致癌基因CUX1产生的含内含子的环状RNA(circ-CUX1)在神经母细胞瘤的发生和侵袭中有重要作用。上调的circ-CUX1 通过与EWSR1结合并促进其与MYC相关的锌指蛋白的相互作用，促进神经母细胞瘤的有氧糖酵解和生长过程，并增加其侵袭性。

4. 血管瘤 血管瘤(hemangioma)是由胚胎期间成血管细胞增生而形成的常见于皮肤和软组织内的先天性良性肿瘤或血管畸形，多见于婴儿出生时或出生后不久。Fu等[29]首次对婴儿血管瘤内的circRNA进行了分析，检测出具有差异性表达的circRNA，同时鉴定出234条上调和374条下调的circRNA。其中，明显上调的是hsa_circ_100933和hsa_circ_100709，下调的是hsa_circ_104310。Li[30]从3例患儿身上获得增殖毛细血管瘤和与之匹配的正常皮肤组织，通过qRT-PCR发现249个表达差异的circRNA，与匹配的正常皮肤对照相比，在血管瘤组织中有124个上调和125个下调的circRNA。hsa_cicRNA_001885和hsa_cicRNA_006612在血管瘤组织中的表达分别是正常皮肤的12.33倍和7.13倍。他们还通过GO和KEGG途径分析差异表达的circRNA的来源基因，GO结果显示，发生差异表达的circRNA来源基因主要参与细胞成分的发生、蛋白质结合。KEGG途径分析则显示，存在差异表达的circRNA起源基因与细胞间信息交流的方式有关。

5. 横纹肌肉瘤 横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)是儿童软组织肉瘤中最常见的一种，是起源于横纹肌细胞或向横纹肌细胞分化的一种恶性肿瘤。Rossi等[31]通过研究circ-ZNF609在儿童横纹肌肉瘤中的表达和功能，加深了circ-ZNF609在细胞周期调控中作用的认识。他们不仅发现circ-ZNF609主要在胚胎型和肺泡型横纹肌肉瘤活检中被上调，还发现在胚胎型横纹肌肉瘤衍生的细胞系中，基因敲除circ-ZNF609导致p-Akt蛋白水平显著下降，该蛋白在细胞周期中发挥着重要作用。其原理大致为circ-ZNF609通过对抗p-Akt蛋白酶体依赖性降解作用，从而作为与细胞增殖相关的途径的新调节剂。此外，Rossi等通过对circ-ZNF609缺失的人原发性成肌细胞进行RNA序列分析，发现circ-ZNF609使得细胞周期相关基因下调和天然免疫基因上调，说明circ-ZNF609与横纹肌肉瘤细胞增殖存在密切联系。

三、小结

随着新一代高通量测序和生物技术的发展，越来越多的学者开始从不同角度深入地研究circRNA，由于circRNA的结构特异、高度保守、在细胞中含量丰富等特点，已经成为分子生物学领域的研究热点。其中，circRNA与肿瘤的关系不容忽视。大量研究表明circRNA在肿瘤的发生、增殖、转移和侵袭等方面都扮演着举足轻重的角色，不过circRNA在儿童恶性实体肿瘤领域中的文献报道比较少。虽然circRNA已被确定的功能尚不完全清楚，但随着对circRNA的进一步研究，更多在儿童肿瘤中差异表达的circRNA将被发现，未来将在诊断、治疗、疾病预后中发挥越来越重要的作用。